靶向SOX9调控弥漫性大B细胞淋巴瘤代谢重编程的研究.pdf
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1、Vol.43 No.10 Oct.2023上海交通大学学报(医学版)JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)Vol.43 No.10 Oct.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)靶向SOX9调控弥漫性大B细胞淋巴瘤代谢重编程的研究张漪蓉1,2,魏玮庆2,马皎2#,张雪1#1.上海中医药大学交叉科学研究院,上海 201203;2.上海交通大学基础医学院生物化学与分子细胞生物学系,上海 200025摘要 目的探索弥漫性大B细胞淋巴瘤(dif
2、fuse large B cell lymphoma,DLBCL)中差异表达的性别决定区Y框转录因子9(SRY-box transcription factor 9,SOX9)基因所起到的作用,尤其是在生发中心B细胞(germinal center B-cell,GCB)来源亚型中对代谢重编程的调控作用。方法选取NCICCR-DLBCL数据库中的481例DLBCL患者的临床信息和基因表达谱数据,使用R语言4.1.3版本进行数据分析与可视化,并基于RNA-seq测序表达量的细胞组织来源亚型(cell of origin subtype,COO)分类算法进行分类;使用ABC/GCB特征注释基因集,
3、通过基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)对分类进行验证。以 SOX9的表达量高低将 ABC和 GCB亚组分别二分类。使用 DEseq2包进行差异分析。使用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)与 Hallmark注释集分析 SOX9与 DLBCL的代谢的关系。采用 Kaplan-Meier方法绘制生存曲线。采用GEPIA2进行泛癌分析。采用ESTIMATE包进行微环境评分分析。结果481例DLBCL患者样本中,481例均有 RNA-seq的表达量数据,421例有临床分期,335例有国际预后指数(
4、international prognostic index,IPI)评分,234例有生存数据。分类得出ABC亚型232例(48.2%)、GCB亚型173例(36.0%)、未分类76例(15.8%),与数据库声明的比例相符,经富集分析验证符合ABC/GCB表达谱特征。SOX9低表达量组与SOX9高表达量组相比,总生存期更短,预后分数更差。泛癌分析示该现象亦可见于其他类型肿瘤。差异分析显示,在GCB亚型中,与SOX9高表达量组相比,SOX9低表达量组中有上调基因156个、下调基因1 826个。对于细胞代谢水平的变化,下调基因富集于糖酵解。结论在ABC-DLBCL中,SOX9基因通过调控代谢重编程
5、影响ABC-DLBCL的生物学特征。低表达SOX9的DLBCL,预示着肿瘤中糖酵解减少;其肿瘤基质细胞浸润程度更低,并且有着更差的预后。关键词性别决定区Y框转录因子9;弥漫性大B细胞淋巴瘤;代谢重编程DOI10.3969/j.issn.1674-8115.2023.10.003 中图分类号R733 文献标志码AResearch on the role of SOX9 in regulating metabolic reprogramming in diffuse large B cell lymphomaZHANG Yirong1,2,WEI Weiqing2,MA Jiao2#,ZHANG
6、Xue1#1.Institute of Interdisciplinary Integrative Medicine Research,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China;2.Department of Biochemistry and Molecular Cell Biology,Shanghai Jiao Tong University College of Basic Medical Sciences,Shanghai 200025,ChinaAbstract Objectiv
7、e To explore the role played by the differentially expressed SRY-box transcription factor 9(SOX9)gene in diffuse large B cell lymphoma(DLBCL),particularly in the regulation of metabolic reprogramming in the germinal center B-cell(GCB)like subtype.Methods The clinical information and gene expression
8、profile data of 481 DLBCL patients retrieved from the NCICCR-DLBCL database were included.Data analysis and visualisation were performed by using R language version 4.1.3.The classification was performed by using a cell of origin subtype(COO)classification algorithm based on RNA-seq sequencing of ex
9、pression.ABC/GCB features were used to annotate gene sets,and the classification was verified by gene set enrichment analysis.The ABC and GCB subgroup was dichotomised based on the mean expression of SOX9.Differential analysis was performed by using the DEseq2 package.The relationship between SOX9 a
10、nd ABC-DLBCL metabolism was analysed by using KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)with the Hallmark annotation set.The survival curves were plotted by using the Kaplan-Meier method.The pan-cancer analysis was performed by using GEPIA2.The microenvironmental scoring analysis was performed 论著
11、 基础研究基金项目 上海市自然科学基金(23ZR1436100)。作者简介 张漪蓉(1996),女,硕士生;电子信箱:。通信作者 张雪,电子信箱:。马皎,电子信箱:。#为共同通信作者。Funding Information Natural Science Foundation of Shanghai(23ZR1436100).Corresponding Author ZHANG Xue,E-mail:.MA Jiao,E-mail:.#Co-corresponding authors.1236张漪蓉,等靶向SOX9调控弥漫性大B细胞淋巴瘤代谢重编程的研究http:/上海交通大学学报(医学版),
12、2023,43(10)by the ESTIMATE package.Results Of the 481 DLBCL patient samples,all the patients had RNA-seq expression data,421 had clinical staging,335 had international prognostic index(IPI)scores and 234 had survival data.The classification yielded 232(48.2%)ABC subtypes,173(36.0%)GCB subtypes and 7
13、6(15.8%)unclassified,consistent with the proportions declared in the database,and the enrichment analysis was verified to be consistent with the ABC/GCB expression profile.Compared to the high SOX9 expression group,the overall survival was shorter in the low SOX9 expression group and the prognostic
14、score was worse.The pan-cancer analysis showed that this phenomenon was also seen in other tumor types.The differential analysis showed that there were 156 upregulated genes and 1 826 downregulated genes in the GCB subtype in the low SOX9 expression group,compared to the high SOX9 expression group.F
15、or metabolic processes,down-regulated genes were enriched in glycolysis.Conclusion In the ABC subtype of DLBCL,the SOX9 gene affects the biological features of ABC-DLBCL by regulating metabolic reprogramming,and low expression of SOX9 in DLBCL,possibly caused by high methylation,predicts decreased g
16、lycolysis in tumors.The proportion of tumor stromal cells decreases,showing a worse prognosis.Key words SRY-box transcription factor 9(SOX9);diffuse large B cell lymphoma(DLBCL);metabolic reprogramming弥 漫 性 大 B 细 胞 淋 巴 瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是成人中最常见的淋巴瘤,具备很强的异质性,在形态学特点和生物学行为等方面均有多样化表现
17、,对以蒽环类药物为基础的经典化学治疗(化疗)方案的预后差异明显1。故此前的研究基于基因表达特征定义了 2 种 DLBCL 亚型:生发中心 B 细胞(germinal center B-cell,GCB)亚型 和 活 化 B 细 胞(activated B-cell,ABC)亚 型,GCB亚型的预后与对化疗的敏感度显著优于ABC亚型1。两者具备不同的遗传学基础、不同的分子生物学特征,故DLBCL的两种亚型也被视作不同的疾病,GCB淋巴瘤通常被认为起源于GCB,而ABC淋巴瘤起源于晚期GCB或浆母细胞的B细胞2,但这些肿瘤的起源细胞在功能上尚未得到严格定义。有研究从表观遗传角度出发解释这两种亚型的
18、起源,鉴定了一组基因 肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor-,TNF-)、性 别 决 定 区 Y 框 转 录 因 子 9(SRY-box transcription factor 9,SOX9)等 16 个,它们在ABC和GCB的甲基化间存在显著差异并与其表达呈负相关,并且可以明确区分两种亚型3。因此了解上述基因在 DLBCL 发生发展中的功能与作用,将有助于理解 DLBCL 的发生发展过程,解释ABC与GCB亚型的起源与差异,对于明确此类患者发病机制及预后相关危险因素有着潜在临床意义,为靶向SOX9治疗DLBCL提供更多的可能性。代谢重编程所致的能量代谢改变,是肿瘤普遍
19、存在的特征之一。主要表现为氧化还原代谢异常、葡萄糖代谢异常、脂肪酸代谢异常等4。肿瘤的代谢重编程通过改变肿瘤细胞的能量代谢方式增强肿瘤的抗逆性,增强营养物质的吸收以能量提供,肿瘤细胞迅速增殖并在不断变化的环境中存活5,以满足其增加的能量需求6。DLBCL是一种侵袭性恶性肿瘤,高度依赖能量供应从而在不同的环境条件下生存7。近年来,越来越多的证据表明,适应性代谢重编程是淋巴瘤增殖过程中能量产生和细胞内生物合成所必需的,这种适应性癌症代谢可用于早期诊断和癌症治疗8。SOX9基因表达有明显的组织特异性,许多报道描述了SOX9在多种已知类型的癌症中表达缺失9,包括套细胞淋巴瘤10、滤泡细胞淋巴瘤11、黑
20、色素瘤12-13等14-15,其在抑制肿瘤细胞生长、增殖和肿瘤发生与复发中起到重要作用。本文从SOX9基因入手,重点阐述其在DLBCL中对于代谢重编程的调控作用,为靶向SOX9治疗DLBCL提供线索。1材料与方法1.1实验材料1.1.1公共数据库从GDC门户网站(https:/portal.gdc.cancer.gov/repository)获得NCICCR-DLBCL数据库中可公开访问的481例临床诊断为DLBCL患者的临床信息和基因表达谱数据16。这些患者中,481例均有RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)的表达量数据,421例有临床分期,335例有国际预后指数(in
21、ternational prognostic index,IPI)评分,234 例有生存数据17-18。GEPIA2(http:/gepia2.cancer- updated:2019/04/07)用于泛癌分析。1.1.2DLBCL 细胞系OCI-LY1细胞在补充有20%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和100 g/mL青霉素/链霉素的 Iscoves Modified Dulbeccos Medium(IMDM)中培养。Karpas-422细胞在补充有20%FBS12372023,43(10)上海交通大学学报(医学版)Vol.43 No.10 Oct.2023JOUR
22、NAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)和 100 g/mL青霉素/链霉素的 RPMI1640 培养基培养。所有的细胞都在5%CO2、37 的二氧化碳加湿培养箱中维持。1.2实验方法1.2.1ABC/GCB亚型分类算法采用细胞组织来源亚型(cell of origin subtype,COO)分类算法进行ABC/GCB 亚 型 分 类。该 算 法 由 REDDY 等19于2017年提出,基于 RNA-seq所测得表达谱数据,以FPKM(fragments per kilobase of exon per million read
23、s mapped)作为测量值,分位数归一化和log2转化的基因表达测量值在基因间进行z归一化。本研究通过分别取ABC、GCB亚型样本中基因表达z分数的平均值来计算每个样本的ABC分数和GCB分数,以ABC分数与GCB分数的差值作为综合亚型分数。如果综合亚型分数0.25 且其 GCB 分数0.75,则样本被归类为ABC;如果综合亚型分数0.25且ABC分数1、多重检验的错误发现率(false discovery rate,FDR)0.05为条件筛选ABC-DLBCL中低表达SOX9和高表达SOX9组中的差异基因(以中位FPKM值区分表达量高低,其中高表达 SOX9 组作为对照组),并绘制火山图。
24、1.2.3 富 集 分 析 与 注 释 基 因 集 来 源 使 用 软 件GSEA 4.1.0 版进行基因富集分析。用于验证 ABC/GCB 分类的注释基因集来源于 signatureDB(https:/lymphochip.nih.gov/signaturedb/)20。用于差异基因功能富集的 Hallmark 基因集和 KEGG 基因集来源于MSigDB v6.0(The Broad Molecular Signatures Database)21。1.2.4 生 存 分 析 基 于 SOX9 表 达 水 平,使 用Kaplan-Meier法分析患者总生存期,用Log-rank检验估计显著
25、性。1.2.5肿瘤浸润使用 R 包 ESTIMATE计算肿瘤的浸润评分,包括基质评分(stromal score)、免疫评分(immune score)和 肿 瘤 纯 度(ESTIMATE score or tumor purity)22。使用t检验计算显著性差异,并用Holm-Sidak法进行多重检验矫正(=0.05)。1.2.6RNA抽提和实时荧光定量 PCRRNA抽提:使用 TRIzol 试剂(天根生化科技有限公司)裂解DLBCL 细胞系样本提取总 RNA。采用 NanoDrop 分析 RNA 纯 度 并 测 定 RNA 浓 度,而 后 用 FastKing gDNA Dispellin
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