靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体的构建及其在肺动脉高压动物模型中的应用.pdf
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1、中国现代医学杂志China Journal of Modern MedicineVol.33 No.17Sept.2023第 33 卷 第 17 期2023 年 9 月靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体的构建及其在肺动脉高压动物模型中的应用*罗志梅1,刘虹延2,孙得胜1(遵义医科大学附属医院 1.呼吸与危重症医学科,2.中医科,贵州 遵义 563003)摘要:目的构建靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体,并应用于肺血管疾病,为后期研究肺血管KLF4基因敲减在肺动脉高压大鼠中的作用及相关分子机制奠定基础。方法根据大鼠KLF4基因序列,设计针对大鼠特异性的siRNA序列,以pHBAAV-
2、U6-MCS-CMV-EGFP作为空白载体,通过酶切技术构建带有GFP荧光标记的KLF4干扰腺病毒载体pHBAAV-r-KLF4 shRNA-GFP,行测序分析,并进行病毒扩增、纯化及滴度测定。本研究对长时间(3个月)接触香烟烟雾的大鼠进行气道注入AAV1-KLF4-shRNA的干预治疗,观察大鼠右心室收缩压、平均右心室压等血流动力学指标改变。结果经测序检测显示,大鼠AAV1-KLF4-shRNA腺相关病毒载体构建成功。健康对照组、生理盐水模型组、对照病毒模型组、治疗干预组的右心室收缩压和平均右心室压比较,差异均有统计学意义(P 0.05)。结论对长时间接触香烟烟雾的肺动脉高压模型大鼠应用AA
3、V1-KLF4-shRNA腺相关病毒载体,能有效改善右心室收缩压和平均右心室压,该载体在相关疾病动物模型中应用有效,为后期顺利开展AAV1-KLF4-shRNA在肺动脉高压中的预防和治疗作用,以及相关分子机制的深入研究提供基础条件。关键词:肺动脉高压;KLF4;腺相关病毒;载体;基因敲减中图分类号:R563.9文献标识码:AConstruction and identification of recombinant adeno-associated virus vector targeting KLF4 gene*Luo Zhi-mei1,Liu Hong-yan2,Sun De-sheng1
4、(1.Department of Respiratory and Critical Care Medicine,2.Department of Traditional Chinese Medicine,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi,Guizhou 563003,China)Abstract:Objective The recombinant adeno-associated virus vector with KLF4 gene knockdown was constructed and applied to pul
5、monary vascular diseases,which laid a foundation for the later study of the role and related molecular mechanism of pulmonary vascular KLF4 gene knockdown in rat pulmonary hypertension.Methods According to the sequence of the rat KLF4 gene,a rat-specific siRNA sequence was designed.Using pHBAAV-U6-M
6、CS-CMV-EGFP as the blank vector,the GFP labeled KLF4 interference adenovirus vector pHBAAV-r-KLF4 shRNA-GFP was constructed by enzyme digestion.The virus was amplified,purified,and titrated.We injected AAV1-KLF4-shRNA into the airway of rats exposed to cigarette smoke for 3 months,and observed the c
7、hanges in hemodynamic indexes such as right ventricular systolic pressure and mean right ventricular pressure.Results The AAV1-KLF4-shRNA adeno-associated virus vector was constructed successfully.The application of adeno-associated virus vector in pulmonary hypertension rats modeled by cigarette sm
8、oke can effectively ameliorate 实验研究 论著DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2023.17.006文章编号:1005-8982(2023)17-0030-07收稿日期:2022-11-25*基金项目:国家自然科学基金(No:81960016,No:82260014);遵义医科大学博士科研启动资金项目No:院字(2018)04号 通信作者 孙得胜,E-mail:desheng_ 30第 17 期罗志梅,等:靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体的构建及其在肺动脉高压动物模型中的应用hemodynamic indexes such as
9、right ventricular systolic pressure and mean right ventricular pressure(P 0.05).Conclusion AAV1-KLF4-shRNA adeno-associated virus vector can be successfully constructed,which plays an important role in the treatment of pulmonary hypertension animal model in the study.Keywords:hypertension,pulmonary;
10、KLF4;adeno-associated virus;vector;gene knockdown基因治疗是借助载体把特定的基因序列导入靶细胞,通过对某种基因进行敲减或者过表达,发挥其相应的功能,达到对相关疾病进行治疗的目的。重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)因其能够长时间稳定表达、对机体无致病性、良好的安全性等优点,渐渐被更多的研究人员青睐,已成为当前基因治疗研究领域中最热门的载体之一1。腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)分为多个不同的血清型,不同分型的AAV对其相应的特定组织有特殊的亲嗜作用,如
11、AAV1 对血管组织有特殊的亲嗜特性。如果以 AAV1 作为载体,联合气道内给药方式,有望构建肺血管基因干预模型。因为在这种情况下,经气道输入的药物会主要分布于肺部血管,复制肺血管疾病模型的效果远远优于传统的使用慢病毒载体或全身基因敲除方法及经血管注药等给药方式。肺动脉高压的特点是肺动脉及右心室收缩压升高,常常引起右心功能不全,预后较差,还往往存在肺远端小血管的重塑2-5。本课题组前期实验显示,转录因子KLF4可能在肺动脉高压的起病中扮演重要角色。肺动脉高压模型组发生肺血管重塑的肺动脉中的 KLF4 表达明显升高,与此同时,标志肺动 脉 平 滑 肌 细 胞 增 殖 水 平 的 增 殖 细 胞
12、核 抗 原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)也明显增多。体外研究还发现,KLF4通过调节AKT的磷酸化影响肺动脉平滑肌细胞的增殖和迁移6。而沉默 KLF4基因,能够有效地阻止肺动脉平滑肌细胞的失控性增殖和迁移,所以进一步探讨敲减肺血管中的KLF4,并检测相应指标,观察其能否有效地缓解肺动脉高压势在必行。本研究拟将已验证有效的 KLF4 小干扰链与AAV1 病毒载体结合,构建沉默 KLF4 基因的重组腺相关病毒载体,进一步扩增、包装病毒载体,并在长时间(3个月)香烟烟雾刺激诱导的肺动脉高压动物模型中使用,为后期KLF4基因敲减在大鼠肺动脉高压中的预
13、防和治疗作用,以及相关分子机制的深入研究奠定基础。1 材料与方法1.1主要材料与动物1.1.1 实验材料 载体 pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP(上海汉恒科技公司),大肠杆菌菌株 DH5(上海汉恒科技公司),限制性内切酶(上海 Thermo公司),T4连接酶(上海Fermentas公司),凝胶回收试剂盒(上海捷瑞生物公司),琼脂糖/粉(上海生工生物工程股份有限公司),DNA ladder(江苏康润生物科技公司),KLF4 的小干扰序列(武汉聚能生物公司),胎牛血清(上海 Gibco 公司),胰蛋白酶(上海Thermo 公司),质粒 DNA 大量抽提试剂盒(北京Tiangen公司),
14、腺相关病毒纯化试剂盒(上海Biomiga公 司),LipofiterTM(上 海 汉 恒 生 物 科 技 公 司),Benonase(上海 Sigma 公司),真核转染试剂(上海汉恒科技公司),DNase I(上海Fermentas公司),原代大鼠肺动脉平滑肌细胞(广州吉尼欧生物公司),AAV-293 细胞(上海汉恒科技公司),PowerLab 生物数据采集分析系统(澳大利亚 ADInstruments 公司),香烟烟雾暴露动物染毒系统(本研究团队自主研发,专利号:ZL201820234399.3)。1.1.2 实验动物 36 只 SPF 级成年雄性 SD 大鼠,8 周龄,体重 185225
15、g,购自湖北实验动物研究中心实验动物生产许可证号:SCXK(鄂)2015-0018。模型复制、测压等动物实验操作均在华中科技大学附属同济医院实验动物中心进行实验动物使用许可证号:SYXK(鄂)2021-0057。本研究由华中科技大学附属同济医院动物实验伦理委员会批准。1.2实验方法1.2.1 确定siRNA序列 根据本课题组前期研究结果6,设计针对大鼠 KLF4 基因特异性的 siRNA 序列,基于 siRNA 序列(GenBank Acc.NM_053713.1)进行 KLF4 shRNA 的设计,并采用 ELBASHIR 等7报道的方法进行筛选,得到沉默效果理想的siRNA序列5-CACC
16、CACACTTGTGACTAT-3。本研究选用的阴性对照序列为5-TTCTCCGAACGTGTCACGTAA-3。31中国现代医学杂志第 33 卷 1.2.2 通过酶切技术构建病毒载体 以pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP 作为空白载体,通过酶切技术构建带有 GFP 荧光标记的 KLF4 干扰腺病毒载体pHBAAV-r-KLF4 shRNA-GFP。具体方法:根据之前实验中筛选的有效靶点合成相关引物,然后进一步退火形成双链片段,用 EcoRI、BamHI 酶切载体通过琼脂糖凝胶电泳检测产物,在凝胶切下目标载体条以回收凝胶,把 siRNA 目的序列插入 U6启动子之后来调控其表达,得到
17、连接的产物,将其转化到大肠杆菌 dh5a 的感受态细胞中,并把克隆进行测序及比对8。1.2.3 载体测序鉴定 转化后的 KLF4-shRNA 平板挑菌,37 250 r/min 摇菌 14 h,对细菌溶液进行测序,并通过DNA测序进行验证。1.2.4 载 体 包 装、扩 增 及 纯 化 重 组 质 粒 pHBAAV-r-KLF4 shRNA-GFP、包装质粒 pAAV-RC 及辅助质粒 pHelper 共转染 AAV-293 细胞,得到表达 EGFP 和 KLF4-shRNA 的 AAV1。对构建的辅助质粒及载体进一步提取,浓度超过1 g/L,A260/280在1.71.8 可用于病毒包装。将
18、用于包装的细胞株AAV-293 细胞以 DMEM+10%FBS,37,5%CO2,相对湿度95%的条件培养。重组病毒颗粒的纯化参照文献9的方法进行。1.2.5 载体滴度测定 通过PCR检测确定包装好的病毒载体的滴度。通过检测病毒基因组中 rAAV载体的基因组拷贝数来测定rAAV的病毒颗粒数,滴度单位用v.g./mL来表示。参照标准品来描绘标准曲线,计算AAV病毒滴度。1.2.6 动物模型复制及治疗干预 采用随机数字表法将 36 只 SD 大鼠随机分为对照组(6 只)和香烟烟雾刺激组(30 只)。置于本课题组自行研制的香烟烟雾染毒箱系统内,参考本课题组之前的方法进行香烟烟雾刺激10,香烟烟雾刺激
19、复制模型3个月后,将香烟烟雾刺激组 27 只大鼠(前段实验中接受烟雾刺激的大鼠死亡3只)随机分为生理盐水模型组、对照病毒模型组(AAV1-control vector)、治疗干预组(AAV1-KLF4-shRNA)组,每组9只。治疗干预组和对照病毒模型组分别经气道给药125 L/只、100 L/只。继续按前述香烟烟雾刺激方法复制模型1个月。健康对照组大鼠不做任何处理。1.2.7 右心导管法检测血流动力学指标 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉。进入麻醉状态后,把大鼠固定在手术台上,小心暴露气管后,进行气管内插管,把气管内导管与小动物呼吸机连接。潮气量为 2 mL/100 g,呼
20、吸频率设为 70 次/min,呼吸比为1 1。采用右心导管法检测血流动力学指标,具体方法:切开大鼠的颈部皮肤,分离大鼠颈静脉,结扎静脉远端,在静脉的近心端剪一楔形口,随之顺势将内置有导丝的测量管插入(导管末端连接探测仪),并轻轻地向前推进,后经锁骨下静脉进入右心房,然后缓慢进入右心室,此时可见导管内有血液回流,立即退出导丝,观察波形并调整导管方向,待波形呈典型右心室压力波形并稳定后记录,最后以PowerLab软件分析右心室收缩压和平均右心室压。1.3统计学方法数据分析采用 Graph Pad Prism 8.0 统计软件。计量资料以均数标准差(xs)表示,比较用方差分析,进一步两两比较用LSD
21、-t 检验。P 0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1序列与对照病毒载体siRNA相对应的shRNA序列见表1;KLF4-shRNA序列见表2。表2与对照病毒载体siRNA相对应的KLF4-shRNA序列基因Top StrandBottom StrandKLF4-shRNA序列AATTCGCACCCACACTTGTGACTATTTCAAGAGAATAGTCACAAGTGTGGGTGTTTTTTGATCAAAAAACACCCACACTTGTGACTATTCTCTTGAAATAGTCACAAGTGTGGGTGCG表 1与对照病毒载体siRNA相对应的shRNA序列基因Top StrandBot
22、tom StrandshRNA序列AATTCGTTCTCCGAACGTGTCACGTAATTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTGGATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGAATTACGTGACACGTTCGGAGAACG 32第 17 期罗志梅,等:靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体的构建及其在肺动脉高压动物模型中的应用2.2KLF4-shRNA测序结果KLF4-shRNA测序结果(下划线为目的序列)。CGGTGAGATTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAGGACGAAACACCGGTCCGC
23、AGAATTCGCACCCACACTTGTGACTATTTCAAGAGAATAGTCACAAGTGTGGGTGTTTTTTGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATT
24、TACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAAT
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