靶向PI3K通路抑制同型半胱氨酸诱导的hVSMCs增殖、迁移和表型转化.pdf
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1、宁夏医科大学学报4缘卷文章编号:1674-6309(2023)07-0660-08论著同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是一种非蛋白质的含硫氨基酸,由蛋氨酸活性形式 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的去甲基化形成。血清 Hcy 水平升高导致的高同型半胱氨酸血症(hyperhomocys原teinemia,HHcy)通过损伤动脉血管壁,诱发并加重动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)和 H 型高血压等疾病的发生发展1-3。血管平滑肌细胞(vas原cular smooth muscle cells,VSMCs)位于血管中膜,通过保持动脉血管壁结构的完整性和调节动脉血管的收缩能
2、力,在 AS 和 H 型高血压等疾病的发病过程中发挥重要作用4。VSMCs 存在高分化、增殖迁移能力弱的收缩表型和低分化、增殖迁移、吞噬能力强的合成表型两种表型,研究5表明,VSMCs 从收缩表型向合成表型的转化是 VSMCs源性泡沫细胞形成的主要机制,进而被认为是AS 进展的重要指标。Hcy 能促进 VSMCs 的增殖、迁移和表型转化6,但机制尚不十分清楚。PI3K/Akt/mTOR信号通路参与多种细胞功能的调节,在细胞的增殖、分化、凋亡和调节葡萄糖转运等方面发挥重要作用7-8,然而 Hcy 是否通过 PI3K/Akt/mTOR 通路调控 VSMCs 增殖、迁移和表型转化未见报道。本研究通过
3、复制 HHcy 人血管平滑肌细胞(human vascular smooth muscle cells,hVSMCs)模型,并给予 PI3K 信号通路抑制剂(LY294002)和激动剂(740Y-P)干预,探究 PI3K/Akt/mTOR 信号通路在 Hcy 诱导的 hVSMCs 增殖、迁移和表型转化中的作用及机制,以期为 AS 和 H 型高血压等疾病的预防和治疗提供实验依据。1材料与方法1.1材料hVSMCs(苏州北纳创联生物技术有限公司),Hcy(美国 Sigma 公司),LY294002(上海碧云天生靶向 PI3K 通路抑制同型半胱氨酸诱导的 hVSMCs增殖、迁移和表型转化潘泓乐1,王
4、秀玉1,曾玥1,马星2,3,徐灵博1,2,3,张鸣号1,2,3(1.宁夏医科大学,银川750004;2.国家卫生健康委员会代谢性心血管疾病研究重点实验室,银川750004;3.宁夏血管损伤与修复研究重点实验室,银川750004)摘要:目的探究 PI3K/Akt/mTOR 信号通路在同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)诱导的人血管平滑肌细胞(human vascular smooth muscle cells,hVSMCs)增殖、迁移和表型转化中的作用。方法体外培养 hVSMCs,给予 100 滋mol 蕴原员Hcy 刺激 48 h,复制高 Hcy 血症细胞模型。采用 MTT 法检测
5、 hVSMCs 增殖,细胞划痕实验检测 hVSMCs 迁移;RT-qPCR 和 Western blot 法检测 hVSMCs 表型标志蛋白 琢-SMA、SM22琢 和 OPN 的 mRNA表达和蛋白表达;Western blot 法检测 PI3K/Akt/mTOR 信号通路相关蛋白的表达。给予 PI3K 信号通路的抑制剂 LY294002 和激动剂 740Y-P 刺激 hVSMCs,检测对 Hcy 所致 hVSMCs 增殖、迁移变化和表型转化的影响。结果Hcy 刺激可以诱导 hVSMCs 发生增殖、迁移及表型转化,并且 hVSMCs 中 PI3K、Akt、mTOR、p-PI3K 和p-Akt
6、 的蛋白表达均升高(P均0.05);给予 PI3K 信号通路抑制剂 LY294002 干预后,与 Hcy 组比较,hVSMCs增殖降低(P0.05);hVSMCs 划痕面积增大(P0.05);琢-SMA 和 SM22琢 mRNA 和蛋白表达量均增加(P均0.05),OPN 的 mRNA 和蛋白表达量均降低(P均0.05)。给予 PI3K 信号通路激动剂 740Y-P 干预后,与 Hcy 组比较则得到了相反的结果。结论Hcy 通过激活 PI3K/Akt/mTOR 信号通路,诱导 hVSMCs 增殖、迁移及由收缩表型向合成表型转化,抑制 PI3K 信号通路对 Hcy 诱导的 hVSMCs 增殖、迁
7、移及表型转化起到保护作用。关键词:PI3K/Akt/mTOR 信号通路;同型半胱氨酸;人血管平滑肌细胞;表型转化中图分类号:砸543.5文献标识码:ADOI院10.16050/ki.issn1674-6309.2023.07.003收稿日期:2022-10-11基金项目:宁夏自然科学基金项目(2021AAC03122);宁夏回族自治区重点研发计划项目(2021BEG03093);宁夏医科大学校级科研项目(XT2022028);宁夏回族自治区大学生创新创业训练计划项目(S202210752012);宁夏医科大学大学生创新创业训练计划项目(X202210752047)作者简介:潘泓乐(2002),
8、女,口腔医学院 2020 级本科生。通信作者:张鸣号(1977),男,教授,硕士研究生导师,主要从事高同型半胱氨酸血症的心血管损伤研究。E-mail:第 45 卷7 期2023 年 7 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University660窑窑7期物技术有限公司),740Y-P(意大利 APE biology 公司),MTT 试剂盒购(中国凯基生物公司),总RNA提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司,逆转录试剂盒(美国 Thermo Fisher Scientific 公司),蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒(中国凯基生物公司),Anti-
9、琢-SMA、Anti-SM22琢、Anti-OPN(美国 Abcam 公司),Anti-PI3K、Anti-p-PI3K、Anti-Akt、Anti-p-Akt、Anti-mTOR(美国 Cell Sig原naling Technology 公司),Anti-茁-actin、HRP 标记二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司),蛋白Marker(美国 Thermo Fisher Scientific 公司),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供合成。1.2细胞培养用含 10%胎牛血清的 DMEM 高糖培养基培养 hVSMCs,使用第 37 代细胞。当 hVSMCs 的融合度达到 80%后,将
10、 hVSMCs 分为正常 Control组、100 滋mol L-1Hcy 组、100 滋mol L-1Hcy+LY294002(PI3K 通路抑制剂)组、100 滋mol L-1Hcy+740Y-孕(PI3K 通路激动剂)组。100 滋mol L-1Hcy 刺激 hVSMCs 48 h,采用 MTT 实验检测hVSMCs 增殖功能;细胞划痕实验检测 hVSMCs迁移功能改变情况;qRT-PCR 和 Western blot 检测 hVSMCs 中 琢-SMA、SM22琢、OPN 的 mRNA 及蛋白表达情况;Western blot 检测 hVSMCs 中 PI3K、p-PI3K、Akt、p
11、-Akt 和 mTOR 的蛋白表达情况。1.3Hcy 刺激 hVSMCs 时间点的筛选使用第 37 代 hVSMCs 细胞,当细胞融合度达到 80%后,将 hVSMCs 分为 Control 组和 Hcy干预组。Hcy 干预组用浓度为 100 滋mol L-1的Hcy 刺激平滑肌 细胞,Control 组给予 等量的DMEM 培养基。在 5%CO2、37 益培养箱中分别培养 0、24、48 和 72 h 后,采用 MTT 实验检测细胞增殖情况,以确定后续实验采用的 Hcy 干预时间。1.4细胞活力测定hVSMCs 以 100 滋L/孔,1伊1031伊104细胞的密度接种于 96 孔板 24 h
12、 使其附着。然后用含100 滋mol L-1Hcy、100 滋mol L-1Hcy+20 滋mol L-1LY294002、100 滋mol L-1Hcy+20 滋g mL-1740Y-P的实验培养基替换生长培养基。细胞再孵育 24、48 和 72 h。每孔中加入 50 滋L MTT,37 益孵育 4 h。取上清,每孔中加入 150 滋L 二甲基亚砜(DMSO),室温孵育 10 min。用微酶联免疫吸附测定仪在570 nm 处记录各孔光密度:OD(加药)-OD(空白)/OD(0 加药)-OD(空白)伊100%。1.5细胞划痕试验用 marker 笔在 6 孔板背后均匀地画出横线,作为标记。将
13、hVSMCs 悬液以 100 滋L/孔(约 5伊103细胞)的体积接种于 6 孔板中,待细胞长至90%95%融合后,用 200 滋L 的枪头按照 marker笔画出的横线在细胞表面进行画线,然后吸去培养基,分别加入含 0、100 滋mol L-1Hcy、100 滋mol L-1Hcy+20 滋mol L-1LY294002、100 滋mol L-1Hcy+20 滋g mL-1740Y-P 的培养基培养 48 h。将 6 孔板取出,在显微镜下观察划痕的面积并进行拍照取样。采用 Image J 软件测量划痕面积。1.6RT-qPCR1.6.1提取总 RNA按照总 RNA 提取试剂盒说明书进行 hV
14、SMCs 中总 RNA 的提取,并逆转录成 cDNA。逆转录反应条件为:42 益 15 min,37 益 5 s,4 益保存。1.6.2引物设计根据 琢-SMA、SM22琢、OPN 的基因序列合成引物,引物序列见表 员。基因名称引物序列(5-3)变性温度/琢-SMA上游:GCCAAGACTGGGACCAGGAA59下游:AAGACTGGGACCAGGAASM22琢上游:TGGCAGTGACCAAGAATGAT56下游:GGTCGTCCGTAGCCTGTCOPN上游:AGCGAGGAGTTGAATGGTGCATAC56下游:AATCTGGACTGCTTGTGGCTGTGGAPDH上游:CATCT
15、CTGCCCCCTCTGCTGA56下游:GGATGACCTTGCCCACAGCCT表 1PCR 引物序列1.6.3PCR扩增反应条件:37益30s,95益5min,95 益 10 s,55 益 30 s,72 益 30 s,共 45 个循环。反应结束后,根据扩增曲线数据,对所得的 Ct 值进行分析,利用公式 2原驻驻Ct计算得到目的基因的相对表达量。驻驻Ct=(Ct 待测样本目的基因-Ct待测样本内参基因)-(Ct 校正样本目的基因-Ct校正样本内参基因)。潘泓乐,等.靶向 PI3K 通路抑制同型半胱氨酸诱导的 hVSMCs 增殖、迁移和表型转化661窑窑宁夏医科大学学报4缘卷1.7West
16、ern blot提取 hVSMCs 各组干预因子刺激 48 h 后的细胞总蛋白,BCA 法测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳,上样(每孔 20 滋L 蛋白样品),电转移至 PVDF 膜。转膜完毕后经 5%脱脂奶粉封闭2 h 后,加入一抗 抗 琢-SMA(1颐1 000)、抗SM22琢(1颐1 000)、抗 OPN(1颐1 000)、抗 PI3K(1颐5 000)、抗 Akt(1颐3 000)、抗 mTOR(1颐2 000)、抗 p-Akt(1颐1 000)和抗 p-PI3K(1颐1 000)在 4 益条件下孵育过夜,再与 1颐5 000 比例稀释的羊抗鼠二抗室温孵育 2 h,滴加 ECL
17、化学发光液,曝光检测目的蛋白和内参。Image Lab 软件进行定量分析,以 茁-actin 为内参,用目的蛋白与 茁-actin 的面积光密度比值表示蛋白质表达水平。1.8统计学方法所有数据采用 GraphPad Prism 5.0 软件进行统计学分析。数据用均值依标准差(x依s)表示,两组间比较采用配对 t 检验,单因素方差分析用于多个样本均值之间的比较,组间两两比较采用SNK-q 验。P臆0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1MTT 法检测不同时间点 Hcy 对细胞增殖活力的影响为了确定 Hcy 刺激 hVSMCs 的作用时间,采用 MTT 实验在 0、24、48 和 72 h 共
18、4 个时间点观察 Hcy 对 hVSMCs 的损伤作用。结果显示,100 滋mol L-1的 Hcy 刺激使细胞增殖能力增加,并在 48 h 时差异有统计学意义(P0.05),见图1。后 续 实 验 均 采 用 100 滋mol L-1的 Hcy 刺 激hVSMCs,培养 48 h 后进行。Control 组Hcy 组*2.01.51.00.50.0时间/h与 Control 组比较*P0.05。图 1MTT 法检测不同时间点 Hcy 对细胞增殖活力的影响(n=3)2.2Hcy 促进 hVSMCs 增殖为了研究 Hcy 对 hVSMCs 增殖的影响,采用MTT 实验检测 100 滋mol L原
19、员Hcy 对 hVSMCs 增殖的影响。结果显示,与 Control 组比较,Hcy 组hVSMCs 的增殖能力增加(P0.05),提示 Hcy 促进了 hVSMCs 增殖,见图 2。2.01.51.00.50.0*Control 组Hcy 组与 Control 组比较*P0.05。图 2Hcy 对 hVSMCs 增殖的影响(n=3)2.3Hcy 促进 hVSMCs 迁移为了验证 Hcy 对 hVSMCs 迁移能力的影响,采用细胞划痕实验观察细胞划伤 48 h 后的迁移能力变化。结果显示,与 Control 组比较,Hcy 组hVSMCs 的划痕面积减小(P0.05),说明在 Hcy暴露的情况
20、下,hVSMCs 的迁移能力增强,见图3。Control 组Hcy 组Control 组Hcy 组*5004003002001000100 滋m100 滋m粤月A.光学显微镜下 hVSMCs 的划痕面积;B.划痕实验测定结果的量化比较;与 Control 组比较*P0.05。图 3Hcy 促进 hVSMCs 迁移(n=3)2.4Hcy 促进 hVSMCs 由吸缩型向合成型转化为了观察 Hcy 对 hVSMCs 表型转化的影响,用 100 滋mol L-1Hcy 处理 hVSMCs 48 h,采用RT-qPCR 和 Western blot 检测 琢-SMA、SM22琢、OPN 的 mRNA 及
21、蛋白表达水平。结果显示,与Control 组比较,Hcy 组 hVSMCs 收缩表型标志蛋白 琢-SMA 和SM22琢 的mRNA及蛋白水平均降低(P均0.01),而 hVSMCs 合成表型标志蛋白 OPN 的mRNA 和蛋白水平均升高(P 均0.05),见图 4。2.5Hcy 对 PI3K 信号通路关键蛋白表达的影响为了观察 PI3K 信号通路是否在 Hcy 诱导hVSMCs 损伤中发挥作用,在 100 滋mol L-1的Hcy 刺激 hVSMCs 48 h 后,采用 Western blot 法分析 PI3K 通路相关蛋白的表达变化。结果显示,在Hcy 刺激后与 Control 组比较,P
22、I3K、Akt、mTOR、p-PI3K 和 p-Akt 的蛋白表达水平均升高(P均0.05),见图 5。662窑窑7期A.琢-SMA mRNA表达水平;B.SM22琢 mRNA表达水平;C.OPN mRNA表达水平;D.-SMA蛋白表达水平;E.SM22琢 蛋白表达水平;F.OPN 蛋白表达水平;G.-SMA、SM22琢 和 OPN 蛋白表达水平条带图;与 Control 组比较*P0.01。图 4Hcy 促进 hVSMCs 由收缩型向合成型转化(n=3)AE.PI3K、Akt、mTOR、p-PI3K 和 p-Akt 蛋白表达水平;F.PI3K、Akt、mTOR、p-PI3K 和 p-Akt
23、蛋白表达水平的条带图;与 Control 组比较*P0.05,*P0.01。图 缘Hcy 对 PI3K 信号通路关键蛋白表达的影响(n=3)2.01.51.00.50.0ABCControl 组Hcy 组DEFG2.01.51.00.50.02.01.51.00.50.0*2.52.01.51.00.50.02.01.51.00.50.00.80.60.40.20.043 kDa23 kDa66 kDa45 kDa琢-SMASM22琢OPN茁-actinABCDEF*0.80.60.40.20.01.00.80.60.40.20.00.60.40.20.00.50.40.30.20.10.00
24、.50.40.30.20.10.0130 kDa76 kDa230 kDa130 kDa76 kDa45 kDaPI3KAktmTORp-PI3Kp-Akt茁-actin潘泓乐,等.靶向 PI3K 通路抑制同型半胱氨酸诱导的 hVSMCs 增殖、迁移和表型转化Control 组Hcy 组Control 组Hcy 组Control 组Hcy 组Control 组Hcy 组Control 组Hcy 组Hcy 组Control 组Hcy 组Control 组Hcy 组Control 组Hcy 组Control 组Hcy 组Control 组Hcy 组Control 组Control 组Hcy 组66
25、3窑窑宁夏医科大学学报4缘卷A.光学显微镜下 hVSMCs 的划痕面积;B.划痕实验测定的量化结果;与 Control 组比较*P0.01;与 Hcy 组比较#P0.01。图 7抑制 PI3K 信号通路可阻止 Hcy 诱导的 hVSMCs 迁移(n=3)与 Control 组比较*P0.01;与 Hcy 组比较#P0.05,#P0.01。图6抑制PI3K信号通路可阻止Hcy诱导的hVSMCs增殖(n=3)2.6抑制 PI3K 信号通路可阻止 Hcy诱导的 hVSM原Cs 增殖为了探讨 Hcy 对 hVSMCs 的作用是否依赖于 PI3K 信号通路,在 Hcy 刺激 hVSMCs 时加入PI3K
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