表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组链球菌的构建及其免疫原性分析.pdf
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1、中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 6 期2023 年 6 月Vol.45,No.6Jun.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202207011表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组链球菌的构建及其免疫原性分析宗雪晴1,赵贤杰1,胡俊冶1,余肇锋1,李国潮1,何颍欣1,黄云飞1,2,马春全1,2,李舜1,2,李亚娟1,2,付强1,2*(1.佛山科学技术学院 动物医学系,广东 佛山 528225;2.佛山佛科院 动物医院有限公司,广东 佛山 528225)摘要:猪圆环病毒2型
2、(PCV2)常与马链球菌兽疫亚种(SEZ)混合感染。为构建表达PCV2 Cap蛋白的重组SEZ并分析其免疫原性,本研究通过PCR扩增PCV2基因和SEZ疫苗株ST171基因的上下游同源臂基因(-up、-down),将上述PCR产物分别与pMD19-T载体连接,分别构建重组质粒pMD19-T-Cap、pMD19-T-Szp-up和pMD19-T-Szp-down。将pMD19-T-Szp-up与pG+host5分别双酶切后构建重组质粒pG+host5-Szp-up;将pMD19-T-Szp-down与pG+host5-Szp-up分别经双酶切后构建重组质粒pG+host5-Szp。上述重组质粒均
3、经酶切和测序鉴定正确后分别经H I酶切pG+host5-Szp载体和pMD19-T-Cap载体后构建重组载体pG+host5-PCV2-Cap-Szp,并使PCV2基因替换基因的166 bp783 bp。经酶切和测序鉴定正确后将该质粒电转化ST171感受态细胞,通过红霉素抗性板筛选重组SEZ PCV2-Cap-Szp/ST171株。通过菌落计数分别绘制PCV2-Cap-Szp/ST171及其亲本菌株ST171的生长曲线;分别采用荧光定量PCR(qPCR)检测重组菌株基因以及亲本菌株ST171基因的转录水平;通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定重组菌株Cap蛋白的表达。结果显示,亲本菌
4、株和重组菌株的生长曲线基本一致,重组菌株中基因的转录水平与亲本菌株中基因的转录水平相当,且其中的蛋白肽段与PCV2 Cap蛋白的肽段相符,表明插入基因不影响ST171的生长特性,且重组菌中的基因可以正常转录并能够表达Cap蛋白。分别经小鼠腹腔接种不同剂量的重组菌株及亲本菌株,并采用改良寇氏法(Karber氏法)计算两株菌对小鼠的半数致死量(LD50)。结果显示,重组菌株及亲本菌株对小鼠的LD50分别为3.21伊108cfu/mL及 2.0伊107cfu/mL,虽然前者对小鼠的LD50有所升高,但其对小鼠的致病性并未增强。将重组菌株及亲本菌株灭活乳化后与商品化的PCV2灭活疫苗分别免疫小鼠,0.
5、5 mL/只,二免后14 d采用间接ELISA检测各组小鼠血清中的Cap蛋白抗体水平,结果显示,免疫亲本菌株及PBS对照小鼠均未产生PCV2 Cap蛋白特异性抗体,而重组菌株刺激小鼠产生的Cap蛋白抗体水平极显著高于PCV2商品化疫苗(0.001)。将上述3株菌按照上述方法分别经腹腔免疫小鼠。二免后14 d经腹腔以0.5 mL 1伊106cfu/mL的SEZ C55138株攻击,观察记录小鼠的死亡情况,并绘制生存曲线;将重组菌株和亲本菌株按照上述方法免疫小鼠,二免14 d后经腹腔接种0.2 mL 1伊108拷贝/mL的PCV2。分别于攻毒后不同时间采血,采用qPCR检测各组小鼠血清中的病毒载量
6、。SEZ C55138株攻毒结果显示,免疫ST171与PCV2-Cap-Szp/ST171的小鼠均未出现临床症状和死亡,存活率达100%;而两个阴性对照组小鼠攻菌后均表现出相应临床症状,并相继死亡,死亡率分别为70%和80%。PCV2攻毒实验结果显示,与免疫ST171组小鼠相比,免疫重组菌株的小鼠在攻击PCV2后1 d、3 d和5 d小鼠血清中的病毒载量均有所降低。上述结果表明,本实验构建的重组菌株PCV2-Cap-Szp/ST171能够诱导免疫小鼠产生高水平的体液免疫反应,并保护小鼠免受致病性SEZ的伤害及减少PCV2攻毒后小鼠血清中的病毒载量,本研究为细菌活载体疫苗及PCV2和SEZ二联疫
7、苗的研发奠定基础。关键词:猪圆环病毒2型;Cap蛋白;马链球菌兽疫亚种;重组菌株中图分类号:S852.6文献标识码:A文章编号:1008-0589(2023)06-0611-10收稿日期:2022-07-13基金项目:国家自然科学基金项目(31872443);广东省基础与应用基础研究基金项目(2022A1515140052);广东省重点建设学科科研能力提升项目(2022ZDJS036);大学生创新创业训练计划项目(202111847019)作者简介:宗雪晴(1998-),女,河南安阳人,硕士研究生,主要从事微生物免疫方面研究.*通信作者:E-mail:*Corresponding author
8、Construction and immunogenicity analysis of recombinantexpressing porcine circovirus type 2 Cap proteinZONG Xue-qing1,ZHAO Xian-jie1,HU Jun-ye1,YU Zhao-feng1,LI Guo-chao1,HE Ying-xin1,HUANG Yun-fei1,2,MA Chun-quan1,2,LI Shun1,2,LI Ya-juan1,2,FU Qiang1,2*(1.Department of Animal Medicine,School of Lif
9、e Science and Engineering,Foshan University,Foshan 528225,China;2.Foshan University Veterinary Teaching Hospital,Foshan 528225,China)Abstract:Porcine circovirus type 2(PCV2)is often co-infected with(SEZ).Toconstruct the recombinant SEZ expressing PCV2 Cap protein and analyze its immunogenicity,the u
10、pstream and downstreamhomologous arm gene sequences(-up and-down)of SEZ vaccine strain ST171gene and PCV2gene were amplifiedby PCR,respectively,and the PCR products were inserted into pMD19-T vector,resulting three recombinant plasmidspMD19-T-Cap,pMD19-T-Szp-up and pMD19-T-Szp-down.The recombinant p
11、lasmid pG+host5-Szp-up was constructed afterdouble digestion of pMD19-T-Szp-up and pG+host5,respectively.The recombinant plasmid pG+host5-Szp was constructed afterdouble digestion of pMD19-T-Szp-down and pG+host5-Szp-up,respectively.Identified by enzyme digestion and sequencing,therecombinant plasmi
12、ds pG+host5-Szp vector and pMD19-T-Cap vector were then digested byH enzyme,respectively,toconstruct the recombinant vector pG+host5-PCV2-Cap-Szp.PCV2 Cap gene was integrated into the 166bp-783bp ofgene.Therecombinant plasmid was electroconverted into ST171competent cells,and the recombinant SEZ PCV
13、2-Cap-Szp/ST171strain wasscreened by erythromycin resistance plate.The growth curves of PCV2-Cap-Szp/ST171and its parent strain ST171were plotted bycolony count.qPCR was used to detect the transcription levels ofgene of the recombinant strain andgene of parent strainST171.The expression of Cap prote
14、in was identified by liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS).The resultsshowed that the growth curves of the parent strain and the recombinant strain were basically the same.The transcription level ofgene in the recombinant strain was similar to that ofgene in the parent strain,and
15、the protein peptide segment in therecombinant strain was consistent with the peptide segment of PCV2 Cap protein in the database,indicating that the insertion ofgene did not affect the growth characteristics of ST171.Thegene in the recombinant bacteria could be transcribed normallyand could express
16、the PCV2 Cap protein.Mice were inoculated with different doses of recombinant strains and parental strainsthrough the abdominal cavity.The modified Karber method was used to calculate the median lethal dose(LD50)of the two strainsto mice.The results showed that the LD50of the recombinant strain and
17、the parent strain were 3.21伊108cfu/mL and 2.0伊107cfu/mL,respectively.Although the LD50of the recombinant strain was increased,the pathogenicity of the recombinant strain wasnot increased.Mice were immunized with 0.5mL of inactivated emulsified recombinant strain PCV2-Cap-Szp/ST171and parentalstrain
18、ST171and commercial PCV2 inactivated vaccine,respectively.Indirect ELISA was used to detect the level of Cap proteinantibodies in the serum of mice in each group 14 days after the second immunization.The results showed that neither the parentstrain nor the PBS control mice produced PCV2 Cap-specific
19、 antibody,but the recombinant strain immunized mice producedCap-specific antibody and the antibody level was significantly higher than that of PCV2 commercial vaccine(0.05)(图4)。表明在基因片段中插入的基因可以在重组菌中正常转录。2.5重组菌株Cap蛋白的LC-MS/MS鉴定结果采用LC-MS/MS检测重组菌株中的蛋白肽段。使用蛋白酶将Cap蛋白水解后形成的肽段复合物经质谱分析,得到的质谱原始文件采用Proteome Di
20、scoverer1.4软件分析,将质谱图上显示的蛋白序列LWLVHPR导入到NCBI中进行Blast比对。结果显示,得到多段蛋白肽段均匹配到NCBI数据库中的PCV2 Cap蛋白的某部分,其中Score分值越大,E值越小证明匹配度越高,筛选到匹配度最高的10个蛋白(图5)。表明检测到重组菌株中定性为Cap蛋白的肽段,即重组菌株能够表达PCV2的Cap蛋白。2.6各菌株对小鼠LD50的测定结果将不同剂量的重组菌株与亲本菌株分别经腹腔注射小鼠,记录14 d内小鼠的临床症状及死亡情况,并计算菌株对小鼠的LD50。结果显示,接种高剂量重组菌的小鼠出现精神萎靡等症状,死亡9只,死亡率达90%;接种低图3
21、重组菌株及亲本菌株的生长曲线109108107106105104103ST171PCV2-Cap-Szp/ST171151050Culture time/hA:重组菌株PCV2-Cap-Szp/ST171的构建策略;B:一次重组菌株的PCR鉴定 M:DL2000 DNA Marker;1:一次同源重组菌;2:SEZ ST171株C:二次同源重组菌PCV2-Cap-Szp/ST171的PCR鉴定M:DL2000 DNA Marker;1、2:采用RT-PCV2-1/2引物经RT-PCR分别鉴定ST171和PCV2-Cap-Szp/ST171株;3、4:采用引物M1/M2经PCR分别鉴定ST171
22、和PCV2-Cap-Szp/ST171株;A:Construction strategy of the recombinant mutant strainsPCV2-Cap-Szp/ST171;B:Identification of the first recombinant strain by PCRM:DL2000 DNA Marker;1:Primary homologous recombination;2:SEZ ST171C:Identification of secondary homologous recombination strain ofPCV2-Cap-Szp/ST171
23、by PCR M:DL2000 DNA Marker;1,2:Identification of ST171and PCV2 Cap-Szp/ST171strains by RT-PCRusing RT-PCV2-1/2 primers;3,4:Identification of ST171and PCV2Cap-Szp/ST171strains by PCR using primer M1/M2图2重组菌株PCV2-Cap-Szp/ST171的构建策略及PCR鉴定结果2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM1 234C2000bp1000bp750bp500bp25
24、0bp100bpM12BAFirst homologous recombinationSecond homologous recombination-up-down-up-down-up-down-up-down-up-downOri TsEmrCol EloripG+host5-CapCapCapOri TsEmrCol EloriCap第一次同源重组第二次同源重组IIIIIIpG+host5-SzpEmrPCV2-Cap中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年616注:Despription为比对到相似序列的基本信息;Scientific name即这条相似序列所在的物种;Query c
25、over 指匹配度;E值代表可信度,E值越小,可信度越高;Pedr Ident指序列匹配的一致性;Acc len指匹配到的序列长度。Note:Despription is the basic information of similar sequencescompared;The Scientific name is the species in which this similarsequence is located;Query cover indicates the matching degree;The E value represents confidence,and the sma
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