SNHG20调控miR-495对甲状腺癌生物学行为的影响.pdf
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1、693基础研究Experimental Research中国现代2023年9 月第2 6 卷第9 期Sep.2023Vo1.26No.9普通外科进展Chin J Curr Adv Gen SurgSNHG20 调控 miR-495 对甲状腺癌生物学行为的影响明鹏1何聪2宁德师范学院附属宁德市医院1乳甲外科2 肿瘤外科(福建宁德352 0 0 0)【摘要】目的:探讨长链非编码RNA(In c RNA)核内小RNA宿主基因2 0(SNHG20)调控微小核糖核酸-495(miR-495)对甲状腺癌生物学行为的影响。方法:qRT-PCR法检测SW579、T PC-1、Nt h y-o r i 3-1细
2、胞中SNHG20、m i R-495的表达;将SW579细胞分为CON组、si-NC组、Si-SNHG20组、si-SNHG20+miR-NC组、si-SNHG20+miR-495 inhibitor组。检测细胞增殖、凋亡、周期和侵袭情况,细胞 MMP-2、E-Ca d h e r i n、N-Ca d h e r i n 蛋白表达情况,验证 SNHG20和miR-495的关系。结果:与正常甲状腺上皮细胞相比,甲状腺癌细胞株SNHG20表达升高,miR-495表达降低(P0.05),且SW579细胞 SNHG20表达最高,miR-495表达最低,因此后续使用 SW579细胞进行转染实验。SNH
3、G20低表达会降低SW579细胞中SNHG20表达、存活率、侵袭个数以及MMP-2和N-Cadherin蛋白表达,升高细胞中miR-495表达、凋亡率、G/G,期细胞比例以及E-Cadherin蛋白表达(P0.05);m i R-495抑制剂可减弱SNHG20低表达对SW579细胞增殖、侵袭的抑制作用,SNHG20靶向调控miR-495表达(P0.05)。结论:低表达 SNHG20可通过靶向调节miR-495抑制甲状腺癌细胞恶性生物学行为。【关键词】LncSNHG20miR-495.甲状腺肿瘤生物学行为【中图分类号】R736.1【文献标识码】Adoi:10.3969/j.issn.1009-9
4、905.2023.09.005【文章编号】10 0 9-990 5(2 0 2 3)0 9-0 6 93-0 6Impact of SNHG20 on biological behavior of thyroid cancerby regulating miR-495MING Peng,HE Cong?Department of Breast Nail Surgery,Department of Oncology,Ningde City Hospital Af-filiated to Ningde Normal University(Ningde 352000,China)ABSTRACT)O
5、bjective:To investigate the impact of long non-coding RNA(lncRNA)small nu-cleolar RNA host gene 20(SNHG20)on the biological behavior of thyroid cancer by regulating mi-croRNA 495(miR-495).Methods:The expression of SNHG20 and miR-495 in SW579,TPC-1 andNthy-ori3-1 cells were detected by qRT-PCR;SW579
6、cells recorded as CON group,si-NC group,si-SNHG20 group,si-SNHG20+miR-NC group,si-SNHG20+miR-495 inhibitor group.Detection ofcell proliferation apoptosis,cycle and invasion,protein expression of MMP-2,E-cadherin,and作者简介】明鹏(198 3-0 2),男,山东泰安人,硕士,主治医师,研究方向:乳甲外科相关。E-mail:中国现代普通外科进展2 0 2 3年9 月第2 6 卷第9 期
7、N-cadherin were detected,and the relationship between SNHG20 and mir-495 was verified.Results:Compared with normal cells,the expression of SNHG20 in thyroid cancer cells was increased,and theexpression of miR-495 was decreased(P0.05),SW579 cells had the highest expression of SNHG20694and the lowest
8、expression of miR-495,so SW579 cells were subsequently used for transfection ex-periments.SNHG20 low expression decreased SNHG20 expression,survival rate,number of invasivecells,MMP-2,N-Cadherin protein expression in cells,and increased miR-495 expression,apoptosisrate,G/G1 phase cell ratio,and E-Ca
9、dherin protein expression(P0.05).miR-495 inhibitor attenuatesthe inhibitory effect of SNHG20 low expression on the proliferation and invasion of SW579 cells.NHG20 targets and regulates miR-495 expression(P 9 8%,被认为是性肿瘤,但仍有一小部分肿瘤表现出异质性,具有侵袭性以及明显的临床病理和分子特征 1-2 。此外,甲状腺癌的具体发病机制仍不十分明确,揭示甲状腺癌分子机制并确定甲状腺癌的新
10、治疗分子靶点迫在眉睫。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是参与基因表达及多种生理和病理过程的新兴调节因子,可以调节癌细胞的增殖、分化、侵袭和迁移,可作为癌症诊断、治疗和预后的生物标志物 3-4。核内小RNA宿主基因 2 0 (small nucleolar RNA host gene 20,SNHG20)表达异常影响多种恶性肿瘤患者预后,如肝癌、膀胱癌、骨肉瘤、结直肠癌、胃癌等 5-6 。但SNHG20在甲状腺癌中的作用机制研究罕见,因此,本研究主要探究SNHG20通过靶向调控miR-495对甲状腺癌细胞生物学行为影响。1材料和方法1.1实验材料和试剂甲状
11、腺癌细胞SW579、TPC-1以及人正常甲状腺上皮细胞Nthy-ori3-1购自中国科学院上海细胞库。PrimeScriptMRT试剂盒(大连TaKaRa公司);SYBRGreenPCRKit试剂盒(北京百奥创新科技有限公司);si-SNHG20、m i R-495抑制剂、miR-495模拟物及各自阴性对照物(广州锐博生物公司);抗体MMP-2、E-Ca d h e r i n、N-Cadherin 和 GAPDH(abcam 公司)。1.2细胞培养与分组细胞 SW579、T PC-1培养在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中,Nthy-0ri3-1细胞培养在含10%胎牛血清RIPM-1
12、640培养基中,所有细胞均放置在37 含5%C02培养箱中培养,待细胞密度达8 0%时,进行传代或实验。1.3细胞转染将处于对数生长期SW579细胞通过Lipofectamine3000转染试剂分别转染si-NC、s i-SNHG20、s i-SNH G 2 0 和 miR-NC、s i-SNH G 2 0 和miR-495 inhibitor 48 h,并记为 si-NC 组、si-SNHG20 组、si-SNHG20+miR-NC 组、si-SNHG20+miR-495inhibitor组,另取正常细胞作为CON组。1.4qRT-PCR法检测细胞SNHG20、mi R-495的表达收集SW
13、579、T PC-1、Nt h y-o r i 3-1细胞以及各组SW579细胞,使用TRIzol试剂提取总RNA。然后使用逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA并使用SYBRGreenPCR试剂盒以cDNA模板进行PCR反应,U6和GAPDH作为内参,使用2-AG法计算目的基因 SNHG20、m i R-495相对表达量。1.5MTT法检测细胞增殖情况各组细胞以1x104个/孔接种到96 孔板中,并在37,5%C02下孵育48h后加人2 0 LMTT溶液,继续孵育4h后,小心弃去上清,加入150 LDMSO充分溶解紫色结晶,通过酶标仪检测490 nm处吸光度值,并计算细胞存活率。1.6流式细胞
14、术检测细胞凋亡和周期情况收集各组细胞,过冷PBS洗涤细胞2 次后,10 0 L结合缓冲液重悬细胞,加人5LAnnexinV-FITC和PI染液室温避光孵育15min,使用流式细胞仪检测细胞调亡情况。收集各组细胞,使用7 5%过冷乙醇固定2 4h后,加人PI染液7 孵育30 min,流式细胞仪检测细胞周期情况。1.7Transwell小室法检测细胞侵袭情况收集各组细胞,使用无血清培养液重悬细胞使密度达1105/mL。预先使用基质胶包被Transwell小室上室,然后加人2 0 0 L细胞液,下室加6 0 0 L完全培养液,放置在37 含5%CO2培养箱中孵育48 h取出下室,小心冲洗后使用4%多
15、聚甲醛固定15min,再使用0.1%结晶紫染色30 min,显微镜下观察细胞695明鹏,何聪.SNHG20调控miR-495对甲状腺癌生物学行为的影响侵袭个数并进行拍照1.8Westernblot检测细胞蛋白表达情况组细胞,加入RIPA裂解缓冲液进行细胞裂解后提取总蛋白并进行定量。然后将蛋白质用10%SDS-PACE进行电泳并转移到PVDF膜上。加入5%脱脂牛奶封闭1h后,加人一抗MMP-2、E-C a d h e r in、N-Cadherin、G A PD H 在4下孵育过夜,然后将膜与HRP偶联的羊抗兔二抗在室温下孵育2 h,化学发光成像仪曝光蛋白条带,ImageJ软件对所得蛋白条带进行
16、量化。1.9双荧光素酶报告基因实验生型质粒(SNHG20-WT)和突变型质粒(SNHG20-MUT),将SNHG20-WT和SNHG20-MUT分别与mimic-NC或miR-495mimic共转染于SW579细胞,48 h后检测荧光素酶活性。1.10统计学处理采用SPSS25.0软件,计量资料以x土s表示,t检验和单因素方差分析用于评估两组和多组之间差异,进一步两组间比较采用SNK-q检验。P0.05表示差异统计学意义。2结果2.1不同甲状腺癌细胞 SNHG20、m iR-49 5的表达与Nthy-ori3-1细胞相比,TPC-1细胞、SW579细胞SNHG20表达明显升高,miR-495表
17、达明显降低(P0.05),且SW579细胞SNHG20表达最高,miR-495表达最低,因此后续使用SW579细胞进行转染实验,见图1。2.51P0.052.0P0.05要1.00.50.0Nthy-ori3-1 TPC-1 SW579细胞图1不同甲状腺癌细胞SNHG20、m i R-495的表达2.2各组细胞SNHG20、m i R-495的表达情况与CON组和 si-NC组相比,si-SNHG20组细胞SNHG20表达明显降低,miR-495表达明显升高(P0.05);与 si-SNHG20 组和 si-SNHG20+miR-NC 组相比,si-SNHG20+miR-495 inhibit
18、or组细胞miR-495表达明显降低(P0.05),见图2。2.3各组细胞增殖情况比较与CON组和si-NC组相比,si-SNHG20组细胞存活率明显降低(P0.05);与 si-SNHG20 组和 si-SNHG20+miR-NC 组1.51收集各0.50.0构建SNHG20野2.572.01.51.00.50.0图2 各组细胞SNHG20、m iR-49 5的表达情况A:各组细胞SNHG20的表达情况;B:各组细胞miR-495的表达情况相比,si-SNHG20+miR-495inhibitor组细胞存活率明显升高(P0.05)。见图3。1507(%)SNHG20miR-495P0.05P
19、0.05Nthy-ori3-1 TPC-1 SW579细胞细胞细胞P0.05P0.05CON组ssi-NC 组 si-SNHG si-SNHG20+si-SNHG20+miR20组miR-NC 组-495inhibitor组P0.05P0.05P0.05P0.05CON组si-NC 组 si-SNHG si-SNHG20+si-SNHG20+miR20组miR-NC组-49 5inhibitor组P0.05P0.05P0.05100-50-0CON组1si-NC 组si-SNHG si-SNHG20+si-SNHG20+miR细胞细胞20组miR-NC组-49 5inhibitor组图3各组细
20、胞增殖情况比较2.4各组细胞调亡和周期比较与CON组和 si-NC组相比,si-SNHG20组细胞调亡率和G/G期细胞比例明显升高,S期细胞比例和Gz/M期细胞比例明显降低(P0.05);与 si-SNHG20组和 si-SNHG20+miR-NC 组相比,si-SNHG20+miR-495 in-hibitor组细胞调亡率和Go/G,期细胞比例明显降低,S期细胞比例和Gz/M期细胞比例明显升高(P0.05P0.05P0.05B中国现代普通外科进展P0.05407P0.056962010-2023年9 月第2 6 卷第9 期CON组P0.05AP0.05口si-NC 组aP0.05口si-SN
21、HG20组口si-SNHG20+miR-NC组si-SNHG20+miR-495 inhibitor 组aaa1.5a1.0adaaaaaa0.001501(%)解凰100500CON 组 si-NC 组 si-SNHG si-SNHG20+si-SNHG20+miR20 组miR-NC组-49 5inhibitor组图4各组细胞凋亡和周期情况比较A:各组细胞调亡情况比较;B:各组细胞周期情况比较组相比,si-SNHG20组细胞侵袭个数明显降低(P0.05);与si-SNHG20组和 si-SNHG20+miR-NC 组相比,si-SNHG20+miR-495 inhibitor组细胞侵袭个数
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