TaqMan-MGB多重荧光定量PCR检测PCV2、PCV3和PCV4方法的建立和应用.pdf
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1、中国兽医杂志():多重荧光定量 检测、和 方法的建立和应用韩 勇 刘玉洁 吕桂霞 马珍驰 任增超 范承祥(山东省日照市动物疫病预防控制中心 山东 日照 山东省东营市现代畜牧业发展中心 山东 东营 山东省枣庄市畜牧渔业事业发展中心 山东 枣庄)摘要:为建立一种可同时鉴别致病性猪圆环病毒()不同基因型的检测方法本试验针对、和 的基因保守区域设计引物和探针将人工合成目的基因与质粒连接构建阳性质粒、和 通过优化引物浓度、探针浓度、退火温度等参数建立、和 多重荧光定量 检测方法并验证该方法的特异性、敏感性和重复性 应用建立的方法对 份临床样品进行应用检测对 个养猪场(户)进行流行病学调查结果显示建立的方
2、法能特异性区分、和 且与其他常见猪病病原不发生交叉反应对、和 的最低检出浓度分别为 、和 拷贝/批内和批间变异系数均小于 重复性好 份临床样品中、和 阳性样品分别为、和 份从 个养猪场(户)采集的 份样品中、和 阳性率分别为、和 结果表明本试验建立的、和 多重荧光定量 检测方法特异性强、敏感性高、重复性好可用于 的快速分型检测为 的临床诊断和流行病学调查提供了检测工具关键词:猪圆环病毒 型 猪圆环病毒 型 猪圆环病毒 型 荧光定量 净化中图分类号:文献标志码:文章编号:()():()./.:收稿日期:基金项目:山东省动物疫情监测与防治项目()日照市动物疫病监测项目(日牧动卫发 号日牧动卫发 号
3、)作者简介:韩勇()男高级兽医师硕士主要从事动物疫病诊断和检测工作:研 究 论 文 卷 猪圆环病毒()是圆环病毒科、圆环病毒属的一种无囊膜环状单链 病毒也是迄今为止发现的具有自主复制能力的最小的动物病毒 目前已鉴定存在 种不同基因型的 分别是猪圆环病毒 型()、猪圆环病毒 型()、猪圆环病毒 型()和猪圆环病毒 型()对动物没有致病性 对猪具有致病性与猪的多种疾病综合征如断奶仔猪多系统衰竭综合征()、猪 皮 炎 肾 病 综 合 征()、猪呼吸道综合征()等有关 还可以穿透母猪的胎盘屏障从而引起胎儿流产、死胎和木乃伊胎等 年 在美国首次被发现可引起母猪繁殖障碍和 年我国首次发现 其能引起猪消化道
4、和呼吸道症状目前对养猪生产危害严重的 主要是其次为、年田瑶等对 份疑似 病料进行 检测、阳性率分别为 、共感染率为 同年田润博等对河南省 个猪场 份组织样品进行 检测 阳性率为 张倩等对 年间于河北省 个猪场采集的 份样本进行检测 阳性率为 、和 作为危害严重的垂直传播疫病在猪群中感染率高而且存在混合感染难以鉴别给净化工作带来较大的难度 目前国内建立的、和 多重荧光 检测方法较少因此需要开发一种快速、特异、有效的 鉴别检测方法 本试验采用比 探针技术特异性和稳定性更强敏感性更高的 探针技术在同一反应体系中同时检测、和 建立 多重荧光定量 方法以期为 的净化提供技术支撑 材料与方法 主要材料、猪
5、伪狂犬病病毒()、乙型脑炎病毒()、猪细小病毒()等病毒含量高的阳性样品经鉴定后由本实验室保存 猪瘟病毒()来源于猪瘟活苗(细胞源)为哈尔滨维科生物技术有限公司产品猪繁殖与呼吸综合征病毒()来源于猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(株)为乾元浩生物股份有限公司产品 份临床样品于 年采集自山东省日照市屠宰场、无害化处理场和部分养猪场(户)中猪的淋巴结或扁桃体 份流行病学调查样品于 年采集自山东省日照市 个养猪场(户)中猪的扁桃体 主要试剂 反应液()、质粒、反转录试剂()均购自北京擎科生物科技股份有限公司/核酸提取试剂盒购自西安天隆科技有限公司、和 单重荧光 检测试剂盒均购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公
6、司 主要仪器 自动核酸提取仪西安天隆科技有限公司产品 荧光定量 仪赛默飞世尔科技有限公司产品 自动破碎仪德国莱驰公司产品 紫外分光光度计上海精密仪器仪表有限公司产品 引物设计和合成在 中分别选取、和 的 基因利用 比对找出序列保守区 利用 软件设计引物和探针(表)由北京擎科生物有限公司 合 成 设 计 结 果 分 别 与 国 内 外 株(、)、株(、)、株(、)的基因序列比较以上毒株均包含设计的探针和引物序列且完全保守 病毒核酸的提取按/核酸提取试剂盒说明书操作分别提 取、的 以及、的 并将提取的 反转录成 保存备用 重组质粒标准品的制备人工合成、和 的 基因序列保守区与质粒 载体连接合成重组
7、质粒、和 测序鉴定正确后作为阳性标准品以上均由北京擎科生物科技股份有限公司完成 多重荧光定量 反应条件优化按照 反应液说明书配制多重荧光定量 扩增体系扩增体系体积为 :反应液 模板各 不同体积的 对引物和探 期韩 勇等:多重荧光定量 检测、和 方法的建立和应用 表 引物和探针序列 基因名称 引物/探针名称/序列()针加无菌水至 反应条件:退火 个循环 主要对引物和探针体积以及退火温度进行优化:将引物和探针的浓度均稀释至 /分别加入引物和探针 、和 进行试验摸索适宜的反应体系退火温度分别设为、和 进行试验摸索适宜的反应条件 特异性试验应用建立的 多重荧光定量 检测方法对、核酸进行检测评价建立方法
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