吡嗪酰胺耐药的耐多药结核分枝杆菌pncA基因表达分析.pdf
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1、879研究论著新医学 2023 年12 月第 54 卷第 12 期吡嗪酰胺耐药的耐多药结核分枝杆菌 pncA 基因表达分析王楠 杨瑜 邓丽 吴玲 刘志辉 孟繁荣【摘要】目的 比较吡嗪酰胺(PZA)耐药的耐多药结核分枝杆菌在 PZA 药物刺激前后 PZA 耐药基因 pncA 的表达,探讨pncA基因表达与结核分枝杆菌PZA耐药的关系。方法 培养PZA耐药的耐多药结核分枝杆菌,检测其利福平和 PZA 最小抑菌浓度(MIC);以 PZA 浓度为 0 和 50 g/mL 的培养基培养菌株,实时荧光定量 PCR 检测菌株 pncA 的表达水平。结果 21 株结核分枝杆菌 PZA 的 MIC 1 600
2、g/mL、12 株为 400800 g/mL、5 株为 100200 g/mL;分别定义相应 PZA 耐药水平为高、中、低,其利福平的 MIC 中位数分别为 128、128、64 g/mL,任意 2 组利福平的MIC 比较差异均无统计学意义(P 均 0.05);以相对定量 2-Ct 法计算 PZA 高、中、低水平耐药结核分枝杆菌 pncA 表达水平,无药组分别为 0.904(0.202,2.653)、1.157(0.658,1.511)、1.147(0.372,1.347),PZA 浓度为 50 g/mL 处理组分别为 1.544(0.611,3.191)、0.846(0.421,1.237)
3、、0.726(0.225,3.017);以无药组为对照,PZA 含药培养组与其对比,pncA 基因表达差异无统计学意义(P 0.05)。结论 PZA 耐药的耐多药结核分枝杆菌在 PZA 药物刺激前后 pncA 表达无明显变化。【关键词】结核分枝杆菌;耐药;吡嗪酰胺;利福平;pncAAnalysis of pncA gene expression in pyrazinamide-resistant and multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis Wang Nan,Yang Yu,Deng Li,Wu Ling,Liu Zhihui,Meng
4、Fanrong.Institue of Pulomonary Diseases,Guangzhou Chest Hospital,State Key Laboratory of Respiratory Disease,Guangzhou 510095,China Corresponding author,Meng Fanrong,E-mail:【Abstract】Objective To compare the expression levels of pncA gene in pyrazinamide(PZA)-resistant and multidrug-resistant Mycoba
5、cterium tuberculosis before and after PZA drug stimulation,and to explore the relationship between PZA-resistant Mycobacterium tuberculosis and pncA gene expression.Methods PZA-resistant and multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis was cultured,and the minimal inhibitory concentration(MIC)of r
6、ifampicin and PZA was detected.The strains were cultured in medium containing 0 and 50 g/mL PZA,and the expression level of pncA was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.Results The MIC of PZA of 21 strains of Mycobacterium tuberculosis was 1 600 g/mL,400-800 g/mL for 12 strains,and 1
7、00-200 g/mL in 5 strains,and their corresponding PZA resistance levels were defined as high,medium and low,respectively.The median MIC of rifampicin was 128,128 and 64g/mL,respectively.Chi-square test showed that there was no significant difference between any two groups(all P 0.05).According to the
8、 relative quantitative 2-Ct method,the expression levels of pncA in the high,medium and low levels of PZA drug-resistant Mycobacterium tuberculosis was 0.904(0.202,2.653),1.157(0.658,1.511)and 1.147(0.372,1.347),and 1.544(0.611,3.191),0.846(0.421,1.237)and 0.726(0.225,3.017)in the 50 g/mL treatment
9、group,respectively.There was no significant difference in pncA gene expression between the control and PZA drug-containing culture groups (P 0.05).Conclusion No significant changes are observed in the expression levels of pncA in multidrug-resistant and PZA-resistant Mycobacterium tuberculosis befor
10、e and after PZA drug stimulation.【Key words】Mycobacterium tuberculosis;Drug resistance;Pyrazinamide;Rifampicin;pncA吡嗪酰胺(PZA)是目前唯一可杀灭巨噬细胞内结核分枝杆菌的关键一线抗结核药物,其耐药问题严峻而其耐药机制尚未完全阐明1。已有的研究表明 PZA 作为前体药物,在 pncA 基因编码的吡基金项目:广东省医学科学技术研究基金项目(A2023284);广州市科技计划项目(202201010697);广州市卫生健康科技项目(20241A011049);广州市结核病研究重点实验
11、室(2023A03J0539)作者单位:510095 广州,广州市胸科医院肺部疾病研究所 呼吸疾病国家重点实验室通信作者,孟繁荣,E-mail:DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2023.12.0072023 年12 月第 54 卷第 12 期880新医学 嗪酰胺酶催化作用下发挥抗结核作用,pncA 基因突变则是结核分枝杆菌 PZA 耐药的主要机制,但pncA 无热点突变区2-5。此外研究表明部分 PZA 耐药结核分枝杆菌未发生 pncA 基因突变,甚至其PZA 酶仍有活性,提示 pncA 突变并非结核分枝杆菌 PZA 耐药的唯一机制6-7。Sheen 等8研究发现在
12、pncA 野生型 PZA 耐药菌株中观察到与 pncA 启动子区域突变相关的低水平 pncA 表达,在 pncA突变型 PZA 耐药菌中 pncA 基因表达水平如何,pncA 基因表达是否为 pncA 基因突变以外的结核菌 PZA 耐药机制之一?目前尚无明确的研究表明pncA的表达是否会影响结核分枝杆菌的PZA耐药,本研究旨在通过分析 PZA 耐药的耐多药结核分枝杆菌 pncA 在 PZA 刺激前后菌株 pncA 基因表达情况,探讨 pncA 表达在结核分枝杆菌 PZA 耐药中是否发挥作用。材料与方法一、材 料1.结核分枝杆菌试验所用结核分枝杆菌来自广州市胸科医院分枝杆菌样本库,菌株入库前均已
13、通过生化和分子方法鉴定为结核分枝杆菌且通过临床药敏诊断实验鉴定为耐多药(同时对异烟肼和利福平耐药),且经 MGIT 960 系统检测其 PZA 药敏性。2.试剂与仪器Middlebrook 7H9/7H10 培养基购自美国 BD 公司、PZA 购自美国 Sigma 公司、TRIzol(200 mL)、逆转录试剂盒(High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits)和荧光定量 PCR 试剂盒为美国 Thermo 有限公司产品。细菌超声分散仪 BAC spreaderTM 1100体必康生物科技(广东)股份有限公司、MP Fastprep-24 5G 快速
14、样品制备仪(美国 MP Biomedicals)、超微量紫外分光光度计(美国 Thermo)、荧光定量 PCR仪 ABI Vin7(美国 ABI)。二、方 法1.结核分枝杆菌复苏从分枝杆菌菌种库中取出结核分枝杆菌,37 孵箱孵育过夜后转种于 7H10 米氏固体培养基,37 培养 34 周。刮取培养基斜面菌落,细菌超声分散仪调整浓度至 1 麦氏。以 1106/mL 终浓度接种于 pH 为 7.0 的 7H9/10 米氏培养基、PZA 浓度 为 0 和 50 g/mL 且 pH 为 5.8 的 7H9 米氏液体培养基。固体培养基上结核分枝杆菌培养 4 周后阿尔玛蓝显色法检测目标菌株利福平和 PZA
15、 的最小抑菌浓度(MIC),PZA 刺激培养组培养 2 周后提取 RNA。2.利福平和 PZA 的 MIC 检测取 pH 为 7.0 的 7H9/10 米氏固体培养基斜面上生长至对数生长期的结核分枝杆菌,细菌超声分散仪调整浓度至 1 麦氏,以 1105/mL 终浓度接种于含 PZA 终浓度为 0、50、100、200、400、800、1 600 g/mL 的 96 孔板中(每孔 200 L,pH 5.8,7H9 米氏液体培养基);以 1106/mL 终浓度接种于 含 0.015 265、0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、64、128、256、512
16、 g/mL 利福平的 96 孔板中(每孔 200 L,pH 7.0,7H9 米氏液体培养基)培养 14 d 后每孔加入 30 L 终浓度为0.2%的刃天青,37 培养72 h后观察显色发现,培养液由蓝色变为玫红色指示结核分枝杆菌生长。3.RNA 提取对数生长期的培养菌液 8 mL,以 10 000 r/min 离心 5 min 后弃上清,加入 1 mL TRIzol 液体后颠倒混匀后转移至裂解介质管中,并置于 MP 快速样品制备仪。快速振荡30 s后冰浴 2 min,重复4次。于4 10 000 r/min 离心 15 min 后取上清至 RNase-free 1.5 mL EP 管,加入 2
17、00 L 氯仿后颠倒混匀,室温静置 5 min。4 10 000 r/min 离心 15 min,上层液体转移至新的RNase-free 1.5 mL EP管中,加600 L异丙醇、60 L 3 mol/L NaAc(pH 5.3)、10 L glogen 后于-70 条件过夜。次日复融后,4 10 000 r/min 离心 15 min 后弃上清,加入 1 mL 75%乙醇重悬,在 4 10 000 r/min 离心 5 min,轻柔弃去液滴后 自然干燥 5 min,加入 50 L RNase-free 水溶解。取 1 L RNA 样品检测浓度,调整浓度后取 10 L 样品逆转录为 cDNA
18、。4.检测 pncA 基因表达实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)扩增 pncA 基因,pncA引物为:上游5-GGTGTTCTACAAGGGTGCCT-3,下游 5-GGTGGCAATACCGACCACAT-3,内参基因为rrs,测得 pncA 基因的 Ct 值。相对定量 2-Ct 法计算 pncA 基因相对表达量。三、统计学处理数据录入 Excel 表格,以 SPSS 26.0、GraphPad软件进行统计分析及绘图。根据试验菌株 pncA 基2023 年12 月第 54 卷第 12 期881新医学 因的 Ct 值计算相对表达量(2-Ct)。本研究数据经 Shapiro-Wilk(W 检
19、验)正态性检验显示数据为非正态分布,以 M(P25,P75)予以统计描述,PZA刺激前后结核分枝杆菌 pncA 基因表达水平对比采用符号秩和检验,多组比较采用 Kruskal-Wallis 秩和检验,P 1 600 g/mL 者 9 株、1 600 g/mL者 12 株、800 g/mL 者 6 株、400 g/mL 者 6 株、200 g/mL 者 2 株、100 g/mL 者 3 株。定义 PZA的 MIC 1 600 g/mL 为 PZA 高水平耐药、400800 g/mL 为中等水平耐药、100200 g/mL 为低水平耐药,将 PZA 耐药菌分为 3 组。二、RFP 耐药水平分析PZ
20、A 高、中、低水平耐药的 3 组菌株利福平的 MIC 经 Shapiro-Wilk(W 检验)正态性检验显示P 0.001,提示数据为非正态分布。PZA 高、中、低水平耐药菌株利福平的 MIC 分别为 128(64,128)、128(64,128)、64(18,96)g/mL。PZA 高、中、低水平耐药组结核分枝杆菌利福平耐药状况示意图见图1。Kruskal-Wallis 秩和检验比较PZA高、中、低水平耐药组利福平的 MIC 比较差异无统计学意义(P=0.203)。三、pncA 本底表达水平检测以荧光定量 PCR 检测菌株 pncA 基因和内参基因rrs的Ct值,2株耐多药PZA敏感菌株为对
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