不同配伍比例金银花-连翘药对的体外抗菌作用研究.pdf
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1、67江西中医药 2023 年 09 月第 9 期总第 54 卷第 489 期中药研究不同配伍比例金银花-连翘药对的体外抗菌作用研究林思绮 司徒杰(广州中医药大学第一附属医院 广州510405)摘要 目的:探讨不同配伍比例金银花-连翘药对对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌的体外抗菌作用,初步分析抗菌作用机制。方法:采用 K-B 纸片法、二倍微量稀释法测定不同配伍比例金银花-连翘药对对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌圈直径、最小抑菌浓度;通过生物化学法测定最佳配伍比例对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌细胞壁碱性磷酸酶、细胞膜核酸外泄量。结果:不同配伍比例金银花-连翘药对(51、41、31、21、11、12、13、
2、14、15)对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌圈直径分别为(11.50 0.30)(16.13 0.45)mm、(10.63 0.59)(14.03 0.51)mm,最小抑菌浓度分别为 7.8262.50mg/mL、31.25125.00mg/mL;最佳配伍比例金银花-连翘药对(11)能显著提高金黄色葡萄球菌、大肠杆菌细胞外碱性磷酸酶、核酸的含量(P15mm 为高度敏感,1015mm 为中度敏感,10mm 为低度敏感。2.4 最小抑菌浓度(Minimuminhibitoryconcentration,MIC)测定通过 96 孔板二倍微量稀释实验8,准确吸取“2.2”项下的 S.aureus、E.
3、coli 菌液稀释液100.0L 于 96 孔微量培养板每排的第 112 孔,再分别准确吸取“2.1”项下的金银花、连翘及不同配伍比例组合物提取液各 100.0L 至每排第 1孔,吹打混匀,准确吸取100.0L混合液至第2孔,同理操作至第 11 孔(弃去 100.0L 混合液),第12 孔准确加入 100.0L 的无菌水作为空白对照;置 37培养 20h,肉眼观察,以孔中溶液未见浑浊者为 MIC;平行 3 份。2.5 菌体细胞外 AKP 含量的测定通过生物化学法实验8,准确吸取“2.2”项下的 S.aureus、E.coli 菌液稀释液 1.0mL 于 EP 管中,根据“2.4”项下的 MIC
4、 测定结果,分别加入适宜浓度的金银花、连翘及最佳配伍比例组合物提取液各1.0mL,使得最终浓度均为 MIC,另外以无菌水作为空白对照;置 37培养 6h,取出后于 10000r/min离心 5min,按照说明书操作测定上清液的 AKP 活性;平行 3 份。2.6 菌体细胞外核酸含量的测定通过生物化学法实验8,准确吸取“2.2”项下的 S.aureus、E.coli 菌液稀释液 1.0mL 于 EP管中,根据“2.4”项下的 MIC 测定结果,分别加入适宜浓度的金银花、连翘及最佳配伍比例组合物提取液各 1.0mL,使得最终浓度均为 MIC,另外以无菌水作为空白对照;置 37培养 6h,取出后于
5、10000r/min 离心 5min,于酶标仪测定上清液的 A260 值;平行 3 份。2.7 统计学方法实验数据采用 SPSS19.0 软件进行 t 检验,以P0.05 表示差异具有统计学意义。3 结果3.1 不同配伍比例金银花-连翘药对的体外抗菌活性由表 1 实验测定结果可知,金银花、连翘单味药对 S.aureus 的 IZD 为 11.73、14.63mm,MIC为 62.5、15.63mg/mL,对 E.coli 的 IZD 为 10.27、12.53mm,MIC 为 125.0、62.5mg/mL;与金银花、连翘单味药相比,金银花-连翘药对在 11 比例时的 IZD 最大、MIC 最
6、低。分析不同比例(51、41、31、21、11、12、13、14、15)配伍发现,对 S.aureus而言,当金银花占比逐渐降低(由 51 至 11),IZD 随着增加、MIC 随着降低,在 11 时表现出最佳抗菌作用;当连翘占比逐渐升高(由 11 至15),IZD、MIC 均以 11 为最优,其他比例的IZD 有所减少,但 MIC 均一致。对 E.coli 而言,当金银花占比逐渐降低,IZD 随着增加、MIC 随着表1 不同配伍比例金银花-连翘药对对S.aureus、E.coli的IZD和MIC药物S.aureusE.coliIZD/mmMIC/(mgmL-1)IZD/mmMIC(mgmL-
7、1)金银花11.730.4062.510.270.42125.00连翘14.630.1515.6312.530.2562.505111.500.3062.5010.630.59125.004112.100.3662.5010.870.31125.003112.900.4062.5011.200.44125.002114.100.2615.6312.270.3262.501116.130.457.8214.030.5131.251215.400.1715.6313.600.7031.251315.000.1015.6313.230.4231.251415.170.2515.6312.300.46
8、62.501515.230.3115.6312.030.2562.50注:药物比例为金银花连翘。69江西中医药 2023 年 09 月第 9 期总第 54 卷第 489 期中药研究降低,在 11 时为最佳抗菌作用;当连翘占比逐渐升高,IZD、MIC 均以 11 为最优,其他比例的IZD 随着减少,MIC 随着升高。3.2 最佳配伍比例金银花-连翘药对的抗菌作用机制图 1、图 2 结果显示,S.aureus、E.coli 正常细胞外的 AKP、核酸含量均比较低,但在金银花、连翘、金银花-连翘药对(11)作用 6h 后,胞外 AKP、核酸含量均显著增加(P0.05);与金银花、连翘单味药相比,金银
9、花-连翘药对(11)在 S.aureus 胞外核酸外泄量方面显著高于金银花(P0.05)。注:与无菌水相比,*P0.05。图1 金银花-连翘药对对S.aureus、E.coli胞外AKP含量的影响注:与无菌水相比,*P0.05;与银翘11相比,#P0.05。图2 金银花-连翘药对对S.aureus、E.coli胞外核酸含量的影响(下转第75页)4 讨论金银花-连翘药对在中成药制剂中的应用广泛,据不完全统计,目前已所涉及利咽解毒颗粒、小儿退热颗粒、金嗓开音丸等 400 多个上市中成药品种,对感冒发烧、流行性腮腺炎、呼吸道感染、病毒性心肌炎等疾病均有疗效4。通过以上研究发现,连翘对 S.aureu
10、s、E.coli的抑菌作用均优于金银花,二者通过不同比例配伍,可表现出不同的体外抗菌活性,其中以金银花-连翘药对配伍比例为 11 时的作用最强,且优于单味药,起到协同增效的作用。同时,当金银花比例增加时,抗菌活性随着减弱,不同配伍比例测得的 IZD、MIC 值均有较大差异;当连翘比例增加时,抗菌活性亦随着减弱,但不同配伍比例测得的 IZD值略有差异,而MIC值基本一致。这可能与金银花-连翘药对配伍前后以及不同配伍比例中的化学成分含量不同有关,如李莉等9亦测得芦丁、绿原酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、连翘脂苷 A、木犀草苷、连翘苷和槲皮素等 8 种成分在金银花-连翘配伍后的含量更高,可与金银花-连翘药
11、对配伍后的抗菌活性强于金银花、连翘单味药相佐证。此外,丁影10测得金银花与连翘合煎液中各成分提取率明显大于单煎液和单煎合并液,同时金银花-连翘药对在 31、21、32、11、23、12、13等不同比例配伍下,以 11 比例中的绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、连翘酯苷 A、芦丁、木犀草苷、连翘苷和槲皮素等 9 个成分含量最高,可与金银花-连翘药对不同配伍比例的抗菌活性高低相佐证。对于金银花-连翘药对的抗菌作用机制研究,发现配伍前后均能破坏 S.aureus、E.coli 的细胞壁、细胞膜的结构,使得通透性增大,致AKP活性(UL-1)AKP活性(UL-1)75江西中医药 2023 年 09
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