茶树4CL基因家族的全基因组鉴定及表达分析.pdf
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1、西北植物学报,2 0 2 3,4 3(9):1 4 5 9-1 4 6 9A c t a B o t.B o r e a l.-O c c i d e n t.S i n.d o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 0-4 0 2 5.2 0 2 3.0 9.1 4 5 9 h t t p:/x b z w x b.a l l j o u r n a l.n e t收稿日期:2 0 2 3-0 4-0 6;修改稿收到日期:2 0 2 3-0 7-0 5基金项目:安溪茶叶重大科技创新专项(A X 2 0 2 1 0 0 1);福建农林大学茶产业链科技创新与服务体系建设项目
2、(K 1 5 2 0 0 0 5 A 0 1);福建张天福茶叶发展基金会科技创新基金项目(F J Z T F 0 1)作者简介:任卫威(1 9 9 7-),男,硕士研究生,主要从事茶树栽培育种与生物技术研究。E-m a i l:2 2 6 9 3 6 4 0 1 7q q.c o m*通信作者:叶乃兴,教授,主要从事茶树栽培育种与茶叶品质化学研究。E-m a i l:y n x t e a 1 2 6.c o m茶树4 C L基因家族的全基因组鉴定及表达分析任卫威,高 婷,邵淑贤,侯炳豪,廖献盛,叶乃兴*(福建农林大学 园艺学院/茶学福建省高校重点实验室,福州 3 5 0 0 0 2)摘 要:
3、4-香豆酸辅酶A连接酶(4 C L)是茶树苯丙烷代谢途径的核心酶,是类黄酮和木质素生物合成的关键酶,对茶树抗胁迫及茶叶品质形成有重要作用。研究通过生物信息学分析,从 黄棪 和 铁观音 茶树中分别鉴定出8个和9个4 C L基因家族成员,命名为HD-C s 4 C L 18和T G Y-C s 4 C L 19。系统发育分析将其分为A和B两组,A组中第亚家族的HD-C s 4 C L 3、HD-C s 4 C L 7、T G Y-C s 4 C L 2和第亚家族的HD-C s 4 C L 2、T G Y-C s 4 C L 5可能分别参与木质素和类黄酮合成。启动子顺式元件分析表明4 C L基因中存
4、在大量与植物发育、激素和胁迫响应相关的顺式作用元件。不同组织转录组数据分析表明,C s 4 C L基因在茶树特定发育时期具有重要作用。实时荧光定量检测 表明,HD-C s 4 C L 6和HD-C s 4 C L 8在G A、M e J A、A B A、低 温和 干旱 处 理 下 表 达 量 均 显 著 上 调;HD-C s 4 C L 7在A B A处理和干旱处理下表达量上调,HD-C s 4 C L 2和HD-C s 4 C L 3在A B A处理下表达量上调。研究为进一步探究茶树4 C L基因家族参与响应多种环境的生物学机制提供参考。关键词:茶树;黄棪;铁观音;4 C L;胁迫;表达分析
5、中图分类号:Q 9 4 3.2;S 5 7 1.1文献标志码:AG e n o m e-w i d e I d e n t i f i c a t i o n a n d E x p r e s s i o n A n a l y s i s o f 4 C L G e n e F a m i l y i n C a m e l l i a s i n e n s i sR E N W e i w e i,GAO T i n g,S HAO S h u x i a n,HOU B i n g h a o,L I AO X i a n s h e n g,Y E N a i x i n g*(C
6、 o l l e g e o f H o r t i c u l t u r e,F u j i a n A g r i c u l t u r e a n d F o r e s t r y U n i v e r s i t y/K e y L a b o r a t o r y o f T e a S c i e n c e a t U n i v e r s i t i e s i n F u j i a n,F u z h o u 3 5 0 0 0 2,C h i n a)A b s t r a c t:4-C o u m a r i c a c i d c o A l i g a
7、 s e(4 C L)i s t h e c o r e e n z y m e i n t h e p h e n y l p r o p a n e m e t a b o l i c p a t h w a y o f t e a t r e e,t h e k e y e n z y m e i n t h e b i o s y n t h e s i s o f f l a v o n o i d s a n d l i g n i n,a n d p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e r e-s i s t a n c
8、 e t o s t r e s s a n d t h e f o r m a t i o n o f t e a q u a l i t y.I n t h i s s t u d y,t h r o u g h b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s,8 a n d 9 4 C L g e n e f a m i l y m e m b e r s w e r e i d e n t i f i e d f r o m t h e C.s i n e n s i s H u a n g d a n a n d C.s i n e n s i
9、 s T i e-g u a n y i n,w h i c h w e r e n a m e d HD-C s 4 C L 1-8 a n d T G Y-C s 4 C L 1-9,r e s p e c t i v e l y.P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s c l a s s i f i e d t h e m i n t o t w o g r o u p s A a n d B.HD-C s 4 C L 3,HD-C s 4 C L 7,T G Y-C s 4 C L 2 o f s u b f a m i l y a n d HD
10、-C s 4 C L 2,T G Y-C s 4 C L 5 o f s u b f a m i l y i n g r o u p A m a y b e i n v o l v e d i n l i g n i n a n d f l a v o n o i d s y n t h e s i s,r e-s p e c t i v e l y.A l a r g e n u m b e r o f c i s-a c t i n g e l e m e n t s r e l a t e d t o p l a n t d e v e l o p m e n t,h o r m o n
11、 e,a n d s t r e s s r e-s p o n s e w e r e f o u n d i n 4 C L g e n e s.A n a l y s i s o f t r a n s c r i p t o m e d a t a f r o m d i f f e r e n t t i s s u e s s h o w e d t h a t C s 4 C L g e n e s p l a y e d a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e s p e c i f i c d e v e l o p m e n t s
12、 t a g e o f t e a t r e e.R e a l-t i m e f l u o r e s c e n c e q u a n t i-t a t i v e d e t e c t i o n s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n s o f HD-C s 4 C L 6 a n d HD-C s 4 C L 8 w e r e s i g n i f i c a n t l y u p-r e g u-l a t e d u n d e r GA,M e J A,A B A,4,a n d d r o u g h
13、t t r e a t m e n t s.T h e e x p r e s s i o n o f HD-C s 4 C L 7 w a s u p-r e g-u l a t e d u n d e r A B A a n d d r o u g h t t r e a t m e n t s.T h e e x p r e s s i o n s o f HD-C s 4 C L 2 a n d HD-C s 4 C L 3 w e r e u p-r e g u l a t e d u n d e r A B A t r e a t m e n t.T h i s s t u d y
14、 p r o v i d e s a r e f e r e n c e f o r f u r t h e r e x p l o r i n g t h e b i o l o g i c a l m e c h-a n i s m o f t e a 4 C L g e n e f a m i l y i n v o l v e d i n r e s p o n d i n g t o v a r i o u s e n v i r o n m e n t s.K e y w o r d s:C a m e l l i a s i n e n s i s;H u a n g d a n
15、;T i e-g u a n y i n;4 C L;s t r e s s;e x p r e s s i o n a n a l y s i s 茶树C a m e l l i a s i n e n s i s(L.)O.K u n t z e 是中国重要的叶用经济作物1,4-香豆酸辅酶A连接酶(4-c o u m a r a t e c o e n z y m e A l i g a s e,4 C L)是植物苯丙烷代谢途径中,类黄酮生物合成的第一步,同时也是木质素生物合成特异途径的关键酶2。p f a m数据库显示,它有AMP结合酶(P F 0 0 5 0 1)和AMP结合酶C端结构
16、域(P F 1 3 1 9 3)2个保守域。此外,4 C L还存在2个高度保守的序列,分别是B O X(S S-G T T G L P K GV)和B O X(G E I C I R G),负责识别、结合和 催 化 反 应 底 物 形 成 相 应 的 辅 酶A3。对4 C L的研究从2 0世纪7 0年代初开始,近3 0年来植物4 C L基因已经被从水稻4、拟南芥5、烟草6、大豆7、杨树8、覆盆子9、桑树1 0、黑麦草1 0等4 0多种植物中相继克隆出来1 2。有研究表明拟南芥中A t 4 C L 1、A t 4 C L 2、A t 4 C L 4参与了木质素的合成5,A t 4 C L 3和水
17、稻中的O s 4 C L 2参与了类黄酮的生物合成。类黄酮化合物是茶树重要的次生代谢产物,与茶叶品质形成密切相关1 4。朱晨1 5研究表明类黄酮与乌龙茶滋味密切相关,是茶叶苦涩味形成的主要原因;邵淑贤等1 6研究发现类黄酮含量较低是黄观音滋味醇和的重要原因;此外,类黄酮对提高植物胁迫的抗性具有重要作用;在茶树中,类黄酮具有清除自由基1 4、逆境胁迫响应1 7等作用。茶树品种 黄棪(C.s i n e n s i s H u a n g d a n)和 铁观音(C.s i n e n s i s T i e-g u a n y i n)原产于福建省安溪县,是乌龙茶类茶树育种的核心种质资源1 8。
18、目前,乌龙茶品种 黄棪1 9和 铁观音2 0的单体型染色体级别基因组于2 0 2 1年5月和7月相继发布。前人已从福鼎大白茶2 1和舒茶早2 2茶树品种中克隆出4 C L基因,R a i n等研究发现C s 4 C L表达与类黄酮含量呈正相关2 3。但目前对4 C L基因参与茶树非生物胁迫响应的研究较少,因此本研究运用生物信息学,在全基因组水平上鉴定 黄棪 和 铁观音 茶树4 C L基因家族,系统分析茶树4 C L的基本结构特点及系统发育,并利用q R T-P C R技术研究茶树4 C L基因家族在GA、M e J A、A B A、低温和干旱处理下的表达模式,以期对茶树4 C L基因家族参与非
19、生物胁迫响应的研究提供参考。1 材料和方法1.1 材料处理试验材料来源于福建农林大学教学茶场,选取长势基本一致盆栽 黄棪 茶树为试验材料。将环境温度下的茶树放入4 恒温培养箱进行模拟低温处理;将 黄棪 茶树从盆栽中拔出,根部洗净后放入1 0%P E G-6 0 0 0中模拟干旱处理。用配制好的1 0 0 m o l/L的GA、M e J A和A B A溶液进行激素喷施处理。收集5 种处理的0(对照组,C K),3,6,1 2,2 4 h后的茶树新稍顶芽下第二叶,每个处理设置3个生物学重复,用锡箔纸包裹放入液氮中固样,放入-8 0 冰箱中保存备用。1.2 茶树4 C L基因家族鉴定在p f a
20、m(h t t p:/p f a m-l e g a c y.x f a m.o r g/)数据库中下载P F 0 0 5 0 1和P F 1 3 1 9 3的隐马可夫模型,分别从茶树 黄棪 和 铁观音 基因组数据库中下载蛋白序列,利用HMME R软件筛选出4 C L基因家族的候选序列,去除结构域不完整的基因序列,再利用S MA R AT(h t t p:/s m a r t.e m b l-h e i d e l b e r g.d e)和N C B I C C D(h t t p s:/www.n c b i.n l m.n i h.g o v/S t r u c t u r e/b w
21、r p s b/b w r p s b.c g i)网站进行结构域验证,满足2个网站验证的为 铁观音 茶树和 黄棪茶树4 C L基因家族成员。将得到的 黄棪 和 铁观音4 C L基因家族成员序列,分别用WO L F P S O R T(h t t p s:/w o l f p s o r t.h g c.j p)网 站 和E x P A S y(h t-t p:/www.e x p a s y.o r g)网站进行亚细胞定位预测和蛋白理化性质进行分析。1.3 茶树4 C L家族成员染色体定位与系统进化树构建 利用T B t o o l s软件将基因文件中在染色体上的分布情况进行可视化处理。从N
22、 C B I蛋白数据库下载杨树、拟南芥、大豆、水稻、川桑、覆盆子及黑麦草的蛋白序列,利用M E G A 7.0软件,选择邻接法,校验值B o o t s t r a p设置设为1 0 0 0重复,构建进化树,利用c h i o p t(h t t p s:/w w w.c h i p l o t.o n l i n e)进行美化。1.4 茶树4 C L基因家族成员基因结构、保守基序分析及蛋白保守结构域分析 用 G S D S(h t t p:/g s d s.c b i.p k u.e d u.c n/)网站0641西 北 植 物 学 报 4 3卷分析茶树4 C L基因结构,将得到的茶树4 C
23、 L蛋白序 列 上 传 到MEME(h t t p:/m e m e-s u i t e.o r g/t o o l s/m e m e)预测其保守基序,利用D NAMAN软件和W e b L o g o(h t t p:/w e b l o g o.b e r k e l e y.e d u/l o-g o.c g i)网站进行多序列比对分析。1.5 茶树4 C L基因家族成员启动子顺式元件分析及组织特异性表达 用T B t o o l s提取茶树HD-C s 4 C L和T G Y-C s 4 C L基因转录起始位点上游2 0 0 0 b p序列,将得到的序列文件上传至P l a n t
24、C A R E(h t t p:/b i o i n f o r m a t i c s.p s b.u g e n t.b e/w e b t o o l s/p l a n t c a r e/h t m l)网站预测启动子顺式元件。下载 黄棪 和 铁观音 的转录组数据,参照前人方法2 4,使用T o p H a t 2软件将转录组所有可用读数映射到茶树基因组,然后通过HT s e q软件计算HD-C s 4 C L和T G Y-C s 4 C L基因在芽、嫩叶、老叶、根和茎上的F P KM值,利用T B t o o l s软件绘制基因在茶树不同组织上的特异表达热图。1.6 实时荧光定量P
25、 C R分析根据基因组织特异性表达分析结果,选取在芽和嫩叶中高表达的基因,利用p r i m e r 3 p l u s网站上进行引物设计(表1),内参基因C s G A P DH登录号为G E 6 5 1 1 0 72 5。q R T-P C R反应在C F X 9 6 T o u c h荧光定量P C R仪上进行,反应体系参照T r a n s s t a r t T i p g r e e n q P C R s u p e r M i x试剂盒方法,反应程序为9 4 3 0 s;9 4 5 s;6 0 3 0 s;4 0个循环。使用2-CT方法计算基因相对表达量2 6,用p r i s
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