参芪温肺方减轻慢性阻塞性肺疾病大鼠的肺气虚证:基于调节NLRP3_GSDMD细胞焦亡通路.pdf
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1、参芪温参芪温肺方减轻慢性阻塞性肺疾病肺方减轻慢性阻塞性肺疾病大鼠的肺气虚证大鼠的肺气虚证:基于调节基于调节NLRPNLRP3 3/G/GSDMDSDMD细胞焦亡通路细胞焦亡通路吴 迪1,王小乐2,高雅婷3,童佳兵1,3,杨勤军1,丁焕章1,张 璐1,李泽庚31安徽中医药大学 中医学院,安徽 合肥 230038;2江西中医药大学附属医院,江西 南昌 330006;3安徽省中医药科学院中医呼吸病防治研究所/安徽省教育厅中医药防治肺系重大疾病重点实验室/安徽中医药大学第一附属医院,安徽 合肥 230031Shenqi Wenfei Formula alleviates chronic obstruc
2、tive pulmonary disease in rats withpulmonary qi deficiency syndrome by regulating NLRP3/GSDMD pyroptosis pathwayWU Di1,WANG Xiaole2,GAO Yating3,TONG Jiabing1,3,YANG Qinjun1,DING Huanzhang1,ZHANG Lu1,LI Zegeng31School of Traditional Chinese Medicine,Anhui University of Chinese Medicine,Hefei 230038,C
3、hina;2Affiliated Hospital of JiangxiUniversity of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330006,China;3Institute of Respiratory Disease Prevention and Treatment inTraditional Chinese Medicine,Anhui Academy of Chinese Medicine/Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine for Prevention andTreatment
4、of Lung Diseases,Anhui Provincial Department of Education/First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine,Hefei 230031,China摘要:目的 探讨参芪温肺方(SQWF)对香烟烟雾联合脂多糖(LPS)诱导的慢性阻塞性肺疾病(COPD)肺气虚证模型大鼠NLRP3/GSDMD信号通路的影响。方法 将SD大鼠随机分为空白组(10 mL/kg,8只)、模型组(10 mL/kg,8只)、SQWF低(2.835 g/kg,8只)、中(5.67 g/kg,8
5、只)、高(11.34 g/kg,8只)剂量组、玉屏风组(1.35 g/kg,8只),建立COPD肺气虚证大鼠模型。观察大鼠体质量、抓力、肺功能、肺组织病理改变、检测外周血中炎性细胞和BALF中炎症因子水平;Q-PCR及免疫组化法检测肺组织NLRP3/GSDMD信号通路相关分子的表达。结果 与空白组相比,模型组大鼠体质量、抓力及肺功能均降低(P0.01)、肺组织病理损伤较重;外周血中WBC、NEU%、MON%水平升高(P0.01),LYM%降低(P0.01),BALF中TNF-、IL-6、IL-1、IL-18含量均升高(P0.01);肺组织中NLRP3、ASC、GSDMD、IL-1、mRNA及其
6、蛋白表达水平升高(P0.01),与模型组相比,SQWF各组及玉屏风组的体质量、抓力、肺功能及肺组织病理明显改善(P0.05);WBC、NEU%及MON%水平降低(P0.01),LYM%升高(P0.01),TNF-、IL-6、IL-1、IL-18含量均降低(P0.01);肺组织NLRP3、ASC、GSDMD及IL-1的mRNA和蛋白阳性表达水平下调(P0.05),且SQWF呈浓度依赖性。结论 参芪温肺方可能通过调节NLRP3/GSDMD通路抑制肺组织细胞焦亡,缓解COPD肺气虚证大鼠炎症反应,减轻肺组织炎性损伤。关键词:参芪温肺方;慢性阻塞性肺疾病;NLRP3/GSDMD;细胞焦亡Abstrac
7、t:Objective To investigate the effects of Shenqi Wenfei(SQWF)Formula on the NLRP3/GSDMD signaling pathway inpulmonary qi deficiency syndrome rats with chronic obstructive pulmonary diseases(COPD).Methods Rat models of COPDand lung qi deficiency syndrome induced by exposure to cigarette smoke and lip
8、opolysaccharide(LPS)injection wererandomized(n=8)for treatment with low-,medium-and high-dose SQWF or Yu Ping Feng(YPF).The changes in body weight,grip strength,lung function,pulmonary pathology,peripheral blood inflammatory cell counts,and levels of inflammatoryfactors in the bronchoalveolar lavage
9、 fluid(BALF)were examined.The expressions of proteins associated with the NLRP3/GSDMD signaling pathway in the lung tissues were determined with RT-qPCR and immunohistochemistry.Results The ratmodels of COPD and lung qi deficiency syndrome showed significantly reduced body weight,grip strength and l
10、ung function(P0.01)with severe lung pathologies,increased levels of WBC,NEU%and MON%(P0.01),decreased LYM%(P0.01),andincreased levels of TNF-,IL-6,IL-1 and IL-18 in the BALF(P0.01);the mRNA and protein expression levels of NLRP3,ASC,GSDMD and IL-1 all increased significantly in the lung tissue(P0.01
11、).Treatment with SQWF and YPF obviously increasedbody weight and improved grip strength,pulmonary function and lung pathology of the COPD rats(P0.05).The treatmentsobviously improved the changes in peripheral blood inflammatory cell counts and inflammatory factors in the BALF of the ratmodels(P0.01)
12、and lowered the expressions of NLRP3,ASC,GSDMD and IL-1 in the lung tissues(P0.05),and the effects of SQWF were dose-dependent.Conclusion SQWF Formula relieves inflammatory response and injury in the lung tissue of COPD rats with pulmonary qideficiency syndrome possibly by inhibiting pyroptosis thro
13、ugh regulating the NLRP3/GSDMD pathway.Keywords:ShenqiWenfei Formula;chronic obstructive pulmonary disease;NLRP3/GSDMD;pyroptosis慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以持续性气流阻塞为特征的一种异质性肺部状态 1,伴咳嗽、咳痰、呼吸困难等慢性呼吸道症状。气道异常导致的慢性气道炎症是COPD的重要发病机制 2,与有毒颗粒和气体暴露等危险因素密切相关,可诱导多种细胞因子并募集炎性细收稿日期:2023-04-27基金项目:国家自然科学基金区域创新发展联合基金重点支持项目(U20A
14、20398);国家自然科学基金青年项目(82205074);安徽省自然科学基金(2208085QH264);安徽省高校协同创新项目(GXXT-2020-025);2022年安徽省教育厅高校优秀科研创新团队(2022AH010035)SupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(U20A20398).作者简介:吴 迪,在读博士研究生,E-mail:通信作者:李泽庚,教授,博士生导师,E-mail:Ldoi 10.12122/j.issn.1673-4254.2023.09.07J South Med Univ,2023,43(9):1500
15、-15081500胞靶向肺组织,从而导致炎症反应的发生 3,4。被细胞内外信号刺激激活的细胞焦亡作为一种程序性细胞死亡方式,常伴随一系列的炎症反应 5。研究发现 6,NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体介导的经典细胞焦亡途径在COPD的发病机制中扮演重要角色。COPD患者外周血单个核细胞中NLRP3 mRNA及血浆中白细胞介素-18(IL-18)和IL-1表达均显著升高 7。香烟烟雾可刺激小鼠肺组织中NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3和凋亡相关微粒蛋白(ASC)的活化,激活半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1),促进消皮素 D(GSDMD)蛋白的裂解,诱导细胞焦亡,释放I
16、L-1和IL-18,加重COPD小鼠肺组织的损伤和炎性细胞焦亡 8,9。因此,抑制NLRP3炎症小体的活化,可能是抑制COPD细胞焦亡发生的关键环节。目前,中医药改善COPD的优势显著,安全可靠 10。针对COPD气虚病证发展规律的病机认识,第四届国医大师韩明向教授根据新安医家吴楚 补肺汤 化裁而成的参芪温肺方(SQWF,专利号ZL 2022 1 0325914.X),由人参、炙黄芪、干姜、陈皮、白术、桔梗和炙甘草七味中药组成,具有温肺化痰,益气平喘之功效。前期临床观察发现,该方可以有效改善COPD肺气虚证患者的咳嗽、咳痰等症状、减少急性加重次数,提高肺功能等。尽管疗效确切,但作用机制尚不明确
17、。SQWF能否通过干预炎症小体介导的细胞焦亡通路影响COPD尚不清楚。本文通过构建COPD肺气虚证大鼠模型,拟从NLRP3炎症小体信号通路阐明SQWF对肺气虚模型大鼠细胞焦亡的影响,探索SQWF改善COPD的可能作用机制。1 材料和方法1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠48只,体质量18020 g,购自邳州市东方养殖有限公司,许可证号:SCXK(苏)2017-0003。按照标准适应性饲养7 d后进行实验。实验通过安徽中医药大学动物伦理委员会批准(AHUCM-rats-2021087),严格按照国家 实验动物管理条例 执行。1.2 药品参芪温肺方药物组成:人参(吉林)10 g、炙黄芪(甘肃)1
18、5 g、干姜(云南)6 g、陈皮(福建)10 g、白术(安徽)10 g、桔梗(安徽)6 g、炙甘草(新疆)6 g,购自安徽中医药大学第一附属医院中药房,中药饮片由该院韩燕全教授鉴定均为正品。每剂药物质量63g。将参芪温肺方药物加入10倍药物重量的蒸馏水(630 mL)煎煮1 h后将药液过滤倒出,药渣再加入8倍重量蒸馏水(504 mL)煎煮40 min后再次过滤,混合两次药液,按临床等效剂量进行换算 11 制得高剂量生药含量 1.134 g/mL,1 mL/100g灌胃,4冰箱保存,蒸馏水稀释应用。玉屏风颗粒(国药集团广东环球制药有限公司,国药准字Z10930036,5 g/袋),用生理盐水配置
19、成浓度为0.135 g/mL的混悬液应用。1.3 材料与试剂脂多糖(LPS,Sigma);雄狮牌过滤嘴香烟(浙江中烟工业有限责任公司,84 mm烤烟型,焦油量:8 mg,烟气烟碱量:0.7 mg;烟气一氧化碳量:10 mg);苏木素伊红染色液(Biosharp);RNA快速提取试剂盒、SYBR定量试剂盒、逆转录酶mix(Sparkjade);DAB显色试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司);NLRP3抗体、ASC抗体、IL-1抗体(Affinity);GSDMD抗体、Caspase-1抗体、IL-18抗体(Proteintech);大鼠TNF-、IL-6、IL-1酶联免疫吸附测定法(ELISA)
20、检测试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司);IL-18检测试剂盒(Elabscience)。1.4 仪器SH-III-50N型抓力检测仪(南京苏测计量仪器有限公司);AniRes2005型动物肺功能分析系统(北京贝兰博科技有限公司);JB-P5型包埋机(武汉俊杰电子有限公司);RM2016型病理切片机(上海徕卡仪器有限公司);CHL2FM3型倒置显微镜(Olympus);Sysmex XN-9000 型全自动血液分析仪(日本希森美康公司);EPOCH2型酶标仪(BioTek);JXFSTPRP-CLN型冷冻研磨仪(上海拓赫机电科技有限公司);Centrifuge 5418R 型 高 速 冷 冻
21、 离 心 机(Eppendorf);Veriti 96-WellThermal Cycler 型 梯 度 PCR 仪(ThermoFisherScientific);LightCycler480 II型实时荧光定量PCR仪(Roche);BioSpectrometerbasic 型 分 光 光 度 计(Eppendorf);NIKON DS-U3型显微成像系统(Nikon)。1.5 COPD大鼠模型构建与给药将大鼠随机分为空白组(Blank)、模型组(Model)、SQWF低(SQWF-L)、中(SQWF-M)、高(SQWF-H)剂量组、玉屏风组(YPF),8只/组。除正常组外,其余各组大鼠采
22、用全身香烟烟雾暴露联合脂多糖气管滴注法构建COPD大鼠模型 12-14:于造模第1和14 天行气道滴注脂多糖(1 mg/kg),滴注当日不烟熏。造模的第228 天(除第1和14 天)将大鼠置于自制烟熏箱中,烟熏1 h/d,空白组不予处理。根据“人与动物等效剂量换算法”计算 15,于造模第29 天起,SQWF低、中、高剂量组分别给予2.835、5.67、11.34 g/kg 灌胃,玉屏风组给予玉屏风颗粒混悬液1.35 g/kg灌胃,空白组和模型组给予等容积的生理盐水灌胃,各组每日给药1次,连续给药14d。1.6 行为学变化观察实验期间大鼠的行为学变化,包括活动情况、精神状态、呼吸、毛发、饮食、等
23、,每周称量体质量,比较各组大鼠体质量变化。http:/www.j-J South Med Univ,2023,43(9):1500-150815011.7 抓力测试使用抓力检测仪测量造模第0、2、4、7周末大鼠的抓力。固定抓力检测仪,使大鼠前爪抓住前部网格,抓取大鼠尾部轻轻向后拉,读取抓力值,每只大鼠测量3次取平均值,统计分析数据。1.8 肺功能检测末次给药结束后,禁食24 h,腹腔注射0.3%戊巴比妥钠(1 mL/100 g)麻醉,使用动物肺功能分析系统检测各组大鼠肺功能。大鼠行气管切开连接双通插管后,仰卧于密闭体积描计箱内,保证气管插管和体描箱气路相连顺畅,待气道压力波形稳定后,测定0.3
24、 s用力肺活量(FEV0.3)、FEV0.3/用力肺活量(FVC)和用力呼气峰值流速(PEF),分析评价大鼠的肺功能。1.9 标本制备与采集肺功能检测完毕后,腹主动脉取血于含EDTA采血管中,轻轻摇晃,用于血细胞检测。剩余外周血于3500 r/min离心15 min,分离血清保存至-80 医用低温冰箱。取血后,迅速打开胸腔,结扎右主支气管,将4 mL无菌培养基缓慢注入左肺,回抽液体,反复灌洗3次,共回收支气管肺泡灌洗液(BALF)约10 mL,用于炎症因子的检测。取右肺上叶组织,4%多聚甲醛固定,用于苏木精-伊红(HE)染色和免疫组织化学(IHC)染色,剩余肺组织用冻存管分装置于液氮快速冷冻,
25、后转移至-80冰箱保存。1.10 HE染色观察肺组织病理学改变将4%多聚甲醛中固定的肺组织经脱水,常规石蜡包埋,制成5 m切片;然后切片经脱蜡后,常规HE染色,脱水封片,显微镜观察各组大鼠肺组织结构和形态学特征。随机截取6张视野图片,在每个视野中心画“十”交叉线,计算每个视野中相交肺泡隔膜数(Ns)、肺泡数(Na)、划线总长度(L)、面积(S),计算肺泡平均截距 16(MLI,m)=L/Ns,平均肺泡数(MAN,个/mm2)=Na/S。1.11 外周血中炎性细胞检测使用血液分析仪检测各组大鼠外周血中白细胞计数(WBC)、中性粒细胞百分比(NEU%)、淋巴细胞百分比(LYM%)、单核细胞细胞百分
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