产肠毒素大肠杆菌四价基因工程灭活疫苗研制.pdf
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1、第 41 卷 第 5 期2023 年 10 月石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University(Natural Science)Vol.41 No.5Oct.2023收稿日期:2022-10-22 基金项目:重庆市教育委员会科学技术研究项目(KJZD-K202202803)作者简介:许崇利(1974),男,博士,从事微生物分子生物学研究。通信作者:许崇波(1968),男,教授,从事微生物分子生物学研究,e-mail:xcb921 。DOI:10.13880/ki.65-1174/n.2023.22.035文章编号:1007-7383(2023)05-056
2、2-06产肠毒素大肠杆菌四价基因工程灭活疫苗研制许崇利1,佘玉罕1,付凤洋1,史沁红1,许崇波2(1 重庆医药高等专科学校医学技术学院,重庆 401331;2 韶关学院英东生物与农业学院,广东 韶关 512005)摘要:目的 利用 PCR 和基因定点突变技术,分别扩增出 K88ac、K99、LTB和突变的 ST1基因,构建了重组菌株 BL21(DE3)(pXKKSL4),酶切鉴定和序列分析表明构建的 pXKKSL4 表达载体包含有 K88ac-K99-3ST1-LTB融合基因且阅读框架正确。方法 SDS-PAGE 分析表明融合蛋白占菌体总蛋白含量的 35.72%。ELISA 检测证实融合蛋白能
3、与ST1单抗、LTB、K88ac 和 K99 抗体相结合。结果 乳鼠灌胃实验表明 K88ac-K99-3ST1-LTB融合蛋白已失去 ST1天然毒性,免疫保护试验表明菌株氢氧化铝佐剂苗和包涵体粗提物氢氧化铝佐剂苗均具有良好的免疫效果,其免疫保护率分为 98%和 96%。结论 上述研究表明构建的四价灭活疫苗不但解决了 ST1肠毒素毒性问题,而且又赋予其免疫原性,同时增加 K99 菌毛可使免疫效果进一步增强,这样从肠毒素和菌毛两种途径,达到预防由 ETEC 引起的腹泻目的,从而有效控制腹泻的发生,为将来制备产肠毒素大肠杆菌基因工程灭活疫苗打下坚实基础。关键词:产肠毒素大肠杆菌;灭活疫苗;融合基因;
4、表达中图分类号:S859.797文献标志码:ADevelopment of a tetravalent genetically engineered inactivated vaccine against enterotoxigenic Escherichia coliXU Chongli1,SHE Yuhan1,FU Fengyang1,SHI Qinhong1,XU Chongbo2(1 College of Medical Technology,Chongqing Medical and Pharmaceutical College,Chongqing 401331,China;2 He
5、nry Fok School of Biology and Agriculture,Shaoguan University,Shaoguan,Guangdong 512005,China)Abstract:Objective The K88ac,K99,LTB and ST1 genes were respectively amplified by PCR and site-directed mutagenesis and the recombinant strain BL21(DE3)(pXKKSL4)was constructed.Enzyme digestion identificati
6、on and sequence analysis showed that the constructed pXKKSL4 expression vector contained K88ac-K99-3ST1-LTB fusion gene and the reading frame was correct.Method The SDS-PAGE analysis showed that the expression level of the fusion proteins were about 35.72%of total cellular protein.ELISA con-firmed t
7、hat the fusion protein could bind to ST1 monoclonal antibody,LTB,K88ac and K99 antibodies.Result The results of intragas-tric test of suckling rat showed that the fusion protein had lost the toxicity of natural ST1 enterotoxin.The immune protection test showed that the aluminum hydroxide adjuvant va
8、ccine of strain and crude extract of inclusion body had good immune effect and the immune pro-tection rate was 98%and 96%.Conclusion The above studies indicated that the constructed tetravalent inactivated vaccine not only solved the toxicity problem of ST1 enterotoxin but also gave it immunogenicit
9、y.At the same time,K99 pili can further enhance the im-mune effect.This could prevent diarrhea caused by ETEC through both enterotoxin and fimbrium pathways so as to effectively control the occurrence of diarrhea.It lays a solid foundation for the preparation of enterotoxigenic Escherichia coli gene
10、tically engineered inactiva-ted vaccine in the future.Key words:Enterotoxigenic Escherichia coli;Inactivated vaccine;Fusion gene;Expression产肠毒 素性大肠杆 菌(Enterotoxigenic Esche-richia coli,ETEC)是一类引起人和幼畜(初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪)腹泻的重要病原菌,初生幼畜被 ETEC 感染后,常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡,发病率和死亡率均很高。ETEC 具有两类致病因子:一类为肠毒素,另一类为粘着素(或称定
11、第 5 期许崇利,等:产肠毒素大肠杆菌四价基因工程灭活疫苗研制563 居因子),已知的粘着素主要有 K88、K99 和 K99 等。ETEC 借助这些粘着素定居于宿主肠道粘膜的上皮细胞上,从而大量繁殖、产生大量肠毒素,由肠毒素造成肠粘膜上皮细胞的病理性变化,导致仔猪黄痢。已知来源于猪的 ETEC 主要粘着素为 K88ac,它是导致仔猪黄痢的间接致泻因子。肠毒素是导致仔猪黄痢的直接致泻因子,包括耐热性肠毒素 ST 和不耐热肠毒素 LT 两种。根据抗原性及宿主差异,ST又分为 ST1和 ST2两类。ST 不具有免疫原性。LT由一个分子量为 28 kDa 的 A 亚单位结合五个分子量为 11.5 k
12、Da 的 B 亚单位组成,全 LT 或其 B 亚单位都具有良好的免疫原性。ETEC 致病率达到 20 40%,死亡率甚至高达 30%50%1-4。对于 ETEC 引起疾病的治疗以药物和疫苗为主,包括以抗肠毒素免疫为主的的类毒素苗或 LT B 亚单位苗;以抗粘附素免疫为基础的的含单价或多价粘附素抗原的灭活全菌苗或亚单位苗。如何避免该病带来的经济损失成为亟待解决的关键问题。目前最有效的措施是采取免疫预防,然而目前使用的传统灭活疫苗大多数存在固有的缺点,且已有的 K88-K99 和 K88ac-LTB基因工程疫苗并没有解决 ST1毒性和免疫原性问题,故而免疫效果并不是十分理想。ST1是引起腹泻最关键
13、的毒素因子,如果不解决这一重要因素达不 到 有 效 的 预 防 效 果 必 将 带 来 巨 大 经 济 损失5-7。为此课题组针对产肠毒素大肠杆菌主要毒力因子粘着素 K88ac、K99 和肠毒素 ST1、LTB构建了重 组 菌 株 BL21(DE3)(pXKKSL4),且 含 有K88ac-K99-3ST1-LTB融合基因的 pXKKSL4 表达载体能高效表达,这样不但解决了 ST1肠毒素毒性问题,而且又赋予其免疫原性,同时增加 K99 菌毛可使免疫效果进一步增强,这样从肠毒素和菌毛两种途径达到预防由 ETEC 引起的腹泻目的,从而有效控制腹泻的发生,必将带来巨大的经济效益和社会效益。1 材料
14、与方法1.1载体和菌株大 肠 杆 菌 C83539、C83902、HB101(pSLM004)ST+强毒株和 DH5(pEWD299)LT+、LTB+菌株由中国兽医药品监察所提供;受体菌 DH5 和 BL21(DE3)、质粒 pET-28a 和 pGEM-T 购自 TaKaRa 公司。1.2试剂T4 DNA 连接酶、限制性核酸内切酶、质粒小量提取试剂盒购自 TaKaRa 公司;卡那霉素,氨苄青霉素、DNA Purification System、PCR 克隆试剂盒购自Promega 公司;K88ac、K99、ST1和 LTB ELISA 检测试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司;健康兔血清和羊抗
15、兔酶标二抗购自 TaKaRa 公司。1.3表达质粒 pXKKSL4 的构建根据 Dykes 和许崇波等报道的 ST、K88ac、K99和 LTB基 因 序 列8-10设 计 了 相 应 引 物。为 了 使ST13端两个半胱氨酸突变为丝氨酸(TGTAGT)设计了 3 对定点突变引物,P1,P2(包含 HindIII、NdeI 酶切位点)、P3,P4(包含 NdeI、EcoRI 酶切位点)、P5,P6(包含 EcoRI、BamHI 酶切位点)。K88ac 扩增所需引物分别为 P7、P8(包含 Bgl、NcoI 酶切位点)。K99 扩增所需引物分别为 P9、P10(包含NcoI、HindIII 酶切
16、位点)。LTB扩增所需引物 P11、P12(包含 BamHI、NotI 酶切位点)。上述引物序列见表 1。表 1引物序列引物引物序列P15-CCCAAGCTTAACAACACATTTTACTGC-3P2 5-GGAATTCCATATG ATAACTTCCAGCACTGGC-3P35-GGAATTCCATATGAACAACACATTTTACTGC-3P4 5-CCGGAATTCATAACTTCCAGCACTGGC-3P55-CCG GAATTCAACAACACATTTTACTGC-3P65-CGCGGATCCATAACTTCCAGCACTGGC-3P7 5-GGAAGATCTCATTTACTGA
17、CTATGAAGAA-3P85-CATGCCATGGGAGAATATCATTTCTTGATAG-3P95-CATGCCATGGA GAT CTT GGG CAG CCT CCT-3P105-CCCAAGCTTAT ATA AGT GAC TAA GAA-3P11 5-CGCGGATCCCCAGACTATTACAGAACTA-3P125-ATAAGAATGCGGCCGCAAGCTTGCCCCTCCAGC-CTAG C-3利用 PCR 引物 P7、P8 和 P9、P10 分别从大肠杆菌 C83902 和 C83539 质粒中分别扩增出了 330 bp K88ac 和 393 bp K99 基因片段
18、,回收 PCR 扩增产物,DNA 连接酶串联后连接至 pGEM-T 载体,构建重组质粒 pXKK2。利用 3 对 PCR 引物 P1、P2,P3、P4 和 P5、P6 扩 增 出 3 个 突 变 的 ST1基 因,T4DNA 连接酶将其串联构成 189bp ST1-ST1-ST1突变基因片段。利用 PCR 引物 P11、P12 从大肠杆菌C83902 质粒中分别扩增出 387 bp LTB基因片段并回收 PCR 扩增产物。将 ST1-ST1-ST1串联突变基因片段与 LTB基因片段用 DNA 连接酶连接并克隆至 pGEM-T 载 体,构 建 重 组 质 粒 pXSL2。Bgl、HindIII
19、和 HindIII、NotI 分别酶切重组质粒 pXKK2和 pXSL2,回收 K88ac-K99 和 ST1-ST1-ST1-LTB片段,T4DNA 连接酶连接串联成 K88ac-K99-3ST1-LTB片段。PCR 反应体系:1 L 模板,2 L 5 mmolL-1 564 石河子大学学报(自然科学版)第 41 卷dNTP,2 L 0.1 mol L-1引物,5 L 10Buffer,1 L 3 UL-1 Taq DNA 聚合酶,39 L ddH2O。PCR 扩增程序为预变性 95 5 min,94 变性 30 s,50 退火 30 s,72 延伸 1 min,30 个循环;72 延伸 5
20、min。pET-28a 和 PCR 扩增产物分别用 Bgl 和NotI 酶切后加入 T4 DNA 连接酶 16 过夜,转化至BL21(DE3)中,涂布于 Kan/LB 平板上,筛选出的阳性克隆扩大培养,提取质粒进行酶切鉴定并送至公司进行序列测定。1.4重组菌株 BL21(DE3)(pXKKSL4)表达产物 SDS-PAGE 分析取 Kan/LB 平 板,吸 取 200 LBL21(DE3)(pXKKSL4)菌液均匀涂布并放置 37 培养 1618 h,挑阳性菌落于含 Kan 抗性的 5 mL 液体 LB 培养基中 170 rmin-1,37 培养过夜。将培养菌液以 1%比例接种到 250 mL
21、 含 30 gmL-1卡那霉素的 LB液体培养基中 37 恒温培养,170 r min-1振摇培养达到对数生长期(OD600=0.40.6)后加入 IPTG,其终浓度为 1 mmol L-1,继续培养 4 h 后收集菌体加入20 mL 50 mmol L-1 Tris Cl-2 mmolL-1 EDTA 缓冲液进行洗涤,12 000 r min-1离心 10 min,加入 10 mL 10 mmol L-1 Tris CL、2 mL Triton X-100 和终浓度 1 mg mL-1的溶菌酶,30 孵育 15 min,超声波破碎 2个 10 s,12 000 rmin-1离心 15 min
22、 收集沉淀进行SDS-PAGE 检测11。1.5K88ac-K99-3ST1-LTB融合蛋 白 的ELISA 检测吸取 BL21(DE3)(pXKKSL4)菌体、阳性对照菌株 HB101(pSLM004)ST+、DH5(pEWD299)LT+强毒株和阴性对照 BL21(DE3)(pET-28a)菌体分别进行超声波破碎,ELISA 检测菌体裂解物。1.6重组菌株 BL21(DE3)(pXKKSL4)的毒性测定重组菌 BL21(DE3)(pXKKSL4)培养物离心收集上清并对沉淀进行裂解制备包涵体粗提物,按照文献提供方法分别实施乳鼠灌胃试验确定融合蛋白是否具有 ST1毒性,当 G/C 值0.09
23、则融合蛋白具有 ST1毒性,如 G/C 值0.083 则融合蛋白已失去ST1毒性12。1.7免疫保护试验BL21(DE3)(pXKKSL4)菌 液 IPTG 诱 导 4 h后,取 50 mL 菌液 12 000 rmin-1离心 10 min,弃上清收集菌体,用 5 mL TE(50 mmolL-1 TrisCl,2 mmol L-1 EDTA)重悬菌体,加入 5 mL 1%TritonX-100 和终浓度 100 gmL-1的溶菌酶,30 水浴静置 15 min,超声波裂解菌体 2 个 10 s 后离心收集沉淀制备包涵体粗提物,将其进行 10 倍稀释并加入10%氢氧化铝胶制备抗原。另外,用终
24、浓度 0.4%甲醛对 BL21(DE3)(pXKKSL4)菌 液(1.24 1010 CFU mL-1)进行灭活,加入 10%氢氧化铝胶混匀,既可作为免疫用抗原。选取 300 只 1822 g 小鼠随机分为 6 组,每组 50 只,菌株氢氧化铝佐剂苗和包涵体粗提物氢氧化铝佐剂苗分别进行腹腔免疫接种,第二次免疫间隔 14 d 后进行,二免 14 d 后进行攻毒试验,两组攻毒剂量分别为 1 MLD 和 2 MLD C83902强毒株。腹腔免疫接种 K88-LTB双价苗作为对照,每组 50 只。1.8中和试验选取 6 只 23 kg 家兔每组 2 只,每组分别用包涵体粗提物氢氧化铝佐剂苗进行腹腔免疫
25、。第一组免疫 20 d 后采集血液并分离血清;第二组免疫 2次,两次免疫间隔时间为 14 d,第 2 次免疫后第 15 d采集血液制备血清;第三组免疫 3 次,每次免疫间隔时间为 14 d,第 3 次免疫后第 10 d 采集血液制备血清,上述血清分别进行乳鼠灌胃中和试验。取 Amp/LB 平板划线接种 HB101(pSLM004)ST+工程菌株,37 培养过夜并挑取阳性菌落接种于 LB 肉汤培养基中,37 过夜培养后按照 1%比例接种于 200 mL LB 肉汤培养基,培养过夜离心收集上清,用生理盐水稀释 10 倍备用。取 10、12、15、17、20 L 制备的 ST1肠毒素,分别用生理盐水
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