蚕蛹源肽锌纳米粒子的制备及其结构表征.pdf
《蚕蛹源肽锌纳米粒子的制备及其结构表征.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《蚕蛹源肽锌纳米粒子的制备及其结构表征.pdf(8页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、廖明君,张自然,惠森,等.蚕蛹源肽锌纳米粒子的制备及其结构表征 J.食品工业科技,2023,44(22):8491.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023020230LIAO Mingjun,ZHANG Ziran,HUI Sen,et al.Preparation and Characterization of Silkworm Pupa SourcePeptide-zincNanoparticlesJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(22):8491.(in Chinese with English
2、 abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023020230 研究与探讨 蚕蛹源肽锌纳米粒子的制备及其结构表征蚕蛹源肽锌纳米粒子的制备及其结构表征廖明君1,张自然1,*,惠森2,陈璐雯1,杨春媛1,张宗凯1,牛改改1(1.北部湾大学食品工程学院,广西高校北部湾海产品高值化利用与预制食品重点实验室,广西钦州535011;2.广西大学轻工与食品工程学院,广西南宁535000)摘要:为开发安全易吸收的补锌制剂,提升蚕蛹的利用价值,通过酶解蚕蛹蛋白制备蚕蛹肽,并将其与锌螯合生成肽锌螯合物。以锌螯合能力为指标,确定蚕蛹肽的酶解制备工艺及蚕蛹肽锌螯合物的制备工艺,采
3、用紫外光谱、荧光光谱、扫描电镜、元素分析仪、粒径分析及红外光谱等技术对螯合前后的样品进行结构表征。结果表明,酶解制备蚕蛹肽的条件为碱性蛋白酶加酶量为 1%、pH8.0、温度 50、酶解时间 6h,该条件下的螯合率达58.05%;肽锌纳米粒的最佳制备条件为肽锌质量比 1:0.5、pH6.5,温度 55,时间 20min,此时螯合率达72.63%;添加硫酸锌后,紫外光谱与荧光光谱强度的减弱显示 Zn2+与蚕蛹肽成功的发生了结合,所得蚕蛹肽-锌螯合物为粒径 71.99nm 的纳米粒子,表面呈均匀的颗粒状结构,锌相对含量达 37.46%,肽链中的-COOH、-NH2和-C=O 是锌离子与蚕蛹肽的主要结
4、合位点。综上,蚕蛹是制备肽锌螯合物的良好原材料,这为丰富有机锌补充剂资源库和蚕蛹综合利用奠定了一定的理论基础。关键词:蚕蛹,肽-锌螯合物,制备工艺,结构表征本文网刊:中图分类号:TS254文献标识码:A文章编号:10020306(2023)22008408DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2023020230PreparationandCharacterizationofSilkwormPupaSourcePeptide-zincNanoparticlesLIAOMingjun1,ZHANGZiran1,*,HUISen2,CHENLuwen1,YANGChunyuan
5、1,ZHANGZongkai1,NIUGaigai1(1.GuangxiCollegeandUniversityKeyLaboratoryofHigh-valueUtilizationofSeafoodandPreparedFoodinBeibuGulf,CollegeofFoodEngineering,BeibuGulfUniversity,Qinzhou535011,China;2.CollegeofLightIndustryandFoodEngineering,GuangxiUniversity,Nanning535000,China)Abstract:Silkwormpupapepti
6、de(SCP)waspreparedbyenzymatichydrolysisandthenchelatedwithsolublezincionstoobtainsilkwormpupapeptide-zincchelates(SCP-Zn),soastodevelopsafeandeasilyabsorbablezincsupplementsandimprovetheutilizationvalueofsilkwormpupa.Takingthezincchelatingcapacityasanindex,theoptimumpreparationprocessofSCP-Znwasdete
7、rmined,andthestructureofbothSCPandSCP-Znwerecharacterizedbyultravioletspectrum,fluorescencespectra,scanningelectronmicroscopy,elementalanalysis,particlesizeanalysisandFouriertransforminfraredspectrum.Theresultsshowedthatthechelationrateofsilkwormchrysalispeptidewas58.05%undertheconditionsof1%alkalin
8、eproteaseplusenzyme,pH8.0,temperature50andenzymatichydrolysistime6h.TheoptimumpreparationconditionsforpreparationofSCP-Znnanoparticleswereasfollows:Massratioofzincpeptide1:0.5,pH6.5,55,time20min,andthechelationrateofzincreached72.63%.Theresultsofultravioletspectrumandfluorescencespectrum收稿日期:2023022
9、2基金项目:广西自然科学基金项目(2022GXNSFBA035555);高层次人才科研启动经费项目(2021KYQD09);中青年项目(2020KY10030);大学生创新训练项目(S202111607186)。作者简介:廖明君(1996),女,学士,研究方向:肽与金属分子间的相互作用,E-mail:。*通信作者:张自然(1984),女,博士,讲师,研究方向:食物组分相互作用,E-mail:。第44卷第22期食品工业科技Vol.44No.222023年11月ScienceandTechnologyofFoodIndustryNov.2023showedthatzincionssuccessfu
10、llycombinedwithSCP.TheobtainedchrysalisSCP-Znbelongstonanoparticleswithanaverageparticlesizeof71.99nm,withuniformgranularstructureonthesurface,andtherelativecontentofzincreached37.46%.The-COOH,-NH2and-C=OinthepeptidechainwerethemainbindingsitesofZn2+andSCP.Theresultsindicatedthatsilkwormpupawasagood
11、rawmaterialforpreparationofzincchelates.Thestudyprovidesatheoreticalbasisforenrichingorganiczincsupplementresourcesandthehighvalueutilizationofsilkwormpupa.Keywords:silkwormpupa;peptides-zincchelate;processoptimization;structuralcharacterization锌是人体必需的微量元素,参与调节细胞生长、基因表达和免疫反应等生理活动,在生命活动中起着重要的作用,锌的缺乏可
12、导致生长迟缓和免疫功能受损1。据报道,目前全球约 17%的人群出现锌缺乏症状,缺锌已成为影响全球性人类健康的一大诱因2。造成机体缺锌的主要原因是日常膳食中锌的生物利用度低,如锌易与植酸形成不溶性复合物,而无法被肠道吸收3。因此,开发有效的补锌剂具有重要的理论和现实意义。传统上的补锌剂如硫酸锌、葡萄糖酸锌等往往存在易在微碱性环境下沉淀、生物利用度低,以及刺激胃肠道等缺点,不宜长期使用2。而食源性蛋白肽可与锌形成螯合物,相比无机锌具有稳定性好、安全、易吸收等优点而成为有效补锌的一种重要形式,具有广阔的应用前景。目前国内外学者已利用动植物蛋白为原料酶解而得多肽,制备出多种肽锌螯合物,如 Zhang
13、等4通过在牡蛎蛋白酶解液中加入硫酸锌,成功制备得到肽锌纳米粒,并对其溶解性、胃肠稳定性和结合机制进行了探讨,结果显示肽锌纳米粒在胃肠道中的溶解性和稳定性显著优于硫酸锌;Peng 等5利用南瓜籽制备得到两条肽锌螯合物在胃肠稳定性和促锌吸收效果方面显著优于无机锌。因此,开发食源性肽补锌制剂具有重要的现实意义。我国桑蚕业历史悠久,是世界蚕桑生产第一大国,蚕蛹年产量高达 65 万吨6。蚕蛹富含蛋白质,且氨基酸组成均衡,是人体理想的蛋白来源。近年来,以蚕蛹蛋白为原料,制备得到多种生理活性肽。例如,Li 等7采用碱提取法获得蚕蛹蛋白,发现采用超声波粉碎-碱性蛋白酶酶解制备得到酶解液对小鼠脾细胞显示了促增殖
14、效果;沈圆圆等8利用纳豆菌液态发酵法成功制备了蚕蛹抗炎活性多肽。其中,相对于其它方法,酶解法制备蚕蛹肽具有操作简便,酶切位点可控等优点,应用前景广阔9。目前,蚕蛹主要作为动物饲料使用,部分用于食品加工,产品有蛋白粉、氨基酸和蛋白纤维等,尚未得到有效的开发利用。国内外学者普遍认为肽中的组氨酸(His)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)和蛋氨酸(Met)与其金属螯合能力密切相关10。资料显示,蚕蛹蛋白质中富含 Asp 和 Glu 等带电氨基酸,分别约占总氨基酸量的 10%和 14%11,可为金属提供丰富的结合位点,提示其中蕴含锌螯合肽片段,是制备肽锌螯合物的良好原料。然而,目前尚未见蚕蛹肽锌
15、螯合物的相关报道。因此,本文以蚕蛹为原料,利用可控酶解技术制备活性肽,探索蚕蛹肽锌螯合物的制备工艺参数,并借助紫外光谱、荧光光谱、粒径分析、红外光谱及扫描电镜等技术手段进行结构表征,期望为补锌制剂的开发及蚕蛹的综合利用提供理论依据。1材料与方法1.1材料与仪器蚕蛹广西靖西鑫晟茧丝绸科技有限公司;甘氨酸、苯并戊三酮(茚三酮)、七水合硫酸锌分析纯,上海国药制药集团;碱性蛋白酶8.6105units/g,丹麦诺维信公司;其他分析试剂均为国产分析纯;MD34-500 透析袋西安优博生物科技有限公司。iCE3500AA 原子吸收光谱仪、Lumina 荧光光度计美国 Thermofisher 公司;纳米粒
16、度及 Zetasi-zerNANO-ZSZeta 电位分析仪英国马尔文仪器有限公司;高分辨场发射扫描电子显微镜德国Zeiss 公司;VarioELcube元素分析仪德国 Elemen-tar 公司;Fnortier-TGA4000红外光谱仪北京北分瑞利分析仪器(集团)有限责任公司。1.2实验方法1.2.1蚕蛹肽的制备1.2.1.1蚕蛹蛋白的提取及预处理参照 Zhou 等12的方法使用正己烷脱脂,并采用碱溶酸沉法提取蚕蛹蛋白质,即于脱脂蚕蛹粉中加入氢氧化钠溶液(1mol/L),质量体积比为 1:10,45 搅拌 5h,离心(8000r/min,10min)取上清液,用 1mol/L 盐酸调pH
17、至 4.0,室温搅拌 10min,离心(8000r/min,10min),取沉淀,用 500Da 透析袋透析除盐后,冻干备用,即为蚕蛹蛋白。参照任子旭等13的方法对蚕蛹蛋白进行超声波改性处理,具体操作如下:在(305)条件下,用超声功率为 530W 的超声波对浓度为50g/L 的蚕蛹蛋白溶液处理 35min。1.2.1.2蚕蛹肽的制备参考赵梓月等14的方法利用碱性蛋白酶制备蚕蛹多肽。将经过超声波处理的蚕蛹蛋白溶液用蒸馏水配制成质量浓度为 10g/L的悬浮液,加入 1%碱性蛋白酶,调整 pH8.0,于 50恒温水摇床中酶解(140r/min)。酶解结束后,100水浴灭酶 10min,冷却至室温,
18、离心(8000r/min,10min),取上清液,备用。通过对比不同酶解时间(0,2,4,6,8,10,12h)下酶解液对锌螯合率的变化,确定适宜的酶解参数。将此条件下制备的酶解液进行膜过滤(0.45m,混合纤维膜)处理,调节蠕动泵转第44卷第22期廖明君,等:蚕蛹源肽锌纳米粒子的制备及其结构表征85速使膜板出口压力稳定在 0.2MPa。收集小于10kDa 组分进行冻干备用,即为螯合用蚕蛹肽(Silk-wormChrysalisPeptide,SCP),于 4 冰箱中保存待用。1.2.2蚕蛹肽锌螯合物的制备取一定体积的10mg/mLSCP 水溶液与一定的体积的硫酸锌(ZnSO4,100mg/m
19、L)混合,调整至一定的 pH,置于恒温水浴摇床(140r/min)中反应至所需时间。取出后冷却,加入 3 倍体积的无水乙醇,4 静置过夜,离心(8000r/min,10min),去除上清液,加入乙醇清洗沉淀 3 次以上,直至用氯化钡检测无硫酸根检出为止,冻干,备用。1.2.3不同因素对蚕蛹肽螯合锌能力的影响为寻找蚕蛹肽锌螯合的最佳工艺参数,本研究对 ZnSO4的质量比(1:0.125、1:0.25、1:0.33、1:0.5、1:1、1:2、1:3)、pH(3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0)、螯合时间(20、40、60、80、100min)以及温度(25、35、45、55、
20、65)等因素对螯合能力的影响进行分析,以期得到蚕蛹肽锌螯合物的最佳制备工艺。首先,在温度 50,pH6.5,分别加入不同剂量的硫酸锌,反应 20min,进行螯合率的测定。并在此基础上,探究不同 pH、螯合时间以及温度下肽对锌螯合率的变化。将最优条件下制备的肽锌螯合物(SilkwormChrysalisPeptide-Zinc,SCP-Zn)冻干,备用。1.2.4水解度的测定采用茚三酮法测定水解度15。取 0.5mL 待测样品,加入蒸馏水补足至 2.0mL,加入茚三酮试剂 1.0mL,立即摇匀,沸水浴 15min,冷却至室温,然后加入 5.0mL40%乙醇,摇匀后,立刻于 570nm 处测定吸光
21、度值。使用蒸馏水为空白参比。采用甘氨酸制作标准工作曲线。水解度计算公式见下式:DH=hhtot100Ch6.25NCmhtot100式中:h 表示被水解的肽键数;htot表示蛋白质总肽键数;Ch表示酶解液中的氨基含量,mol/L;Cm表示原料蛋白质中游离氨基的含量,mmol/g;N 表示酶解液蛋白含量,mg/mL;6.25 表示蛋白换算系数;蚕蛹的 htot=8.0916。1.2.5锌螯合能力的测定肽锌螯合能力的测定用螯合率来表示,螯合率(%)=(螯合锌含量/总锌含量)100。锌含量的测定采用 GB5009.14-2017 原子吸收法。其中,螯合锌的提取采用乙醇沉淀法,如 1.2.2所述。1.
22、2.6蚕蛹肽锌螯合物的结构表征1.2.6.1紫外光谱分析向 20mL5mg/mLSCP 溶液中分别加入不同量的 ZnSO4,使 Zn2+浓度为 0、1、2、4、8、16mmol/L,室温反应 30min 后,过 0.45m混合纤维膜,取滤液备用。分别采用全自动紫外扫描仪于 200500nm范围内分别进行全波长扫描,考察锌的加入量对蚕蛹肽中的分子外层电子跃迁情况的影响,进而探究肽锌螯合情况,采用去离子水调零。1.2.6.2荧光光谱分析向 20mL5mg/mLSCP 溶液中分别加入不同量的 ZnSO4,使 Zn2+浓度为 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9mmol/L,室温反应30min 后,
23、过 0.45m 混合纤维膜,取滤液备用。采用荧光光谱仪测定锌对肽内源荧光及肽构象的影响。测定条件如下:激发波长为 280nm,发射波长为 300500nm,裂缝宽度为 10nm,PMT 为 450V4。1.2.6.3形貌观察采用高分辨率场发射扫描电镜测定新鲜制备的 SCP 和 SCP-Zn 的表面形貌。即将待测样冻干粉均匀喷涂于导电胶上,喷金后采用 FE-SEM 观察形貌。1.2.6.4元素组成分析采用元素分析仪测定元素组成。样品前处理与形貌观测处理方法相同。1.2.6.5粒度分析采用动态光散射技术(DLS)在Nano-ZS 上测定 SCP-Zn 的粒径分布和多分散系数(PDI)。采用超纯水作
24、为分散液稀释样品至 1mg/mL,于 25 下进行测定,每个样品至少平行测定三次以上。1.2.6.6傅里叶变换红外光谱分析采用傅里叶变红外光谱仪对 SCP-Zn 的二级结构进行测定,测定方法参考 Van 等17和蔡沙等18的方法进行改进。各取约 25mgSCP-Zn 冻干粉及 SCP 冻干粉分别与225mg 溴化钾在研钵中磨匀,压成薄片后放入红外光谱仪进行扫描,扫描波长范围为 4004000cm1,连续扫描 128 次,分辨率为 2cm1。1.3数据处理采用 SPSS17.0 软件对数据进行方差分析与显著性分析,P0.05 表示差异显著,采用 Origin 软件制图。2结果与分析2.1酶解时间
25、对肽锌螯合物形成的影响以水解度和螯合率为指标考察酶解时间对肽锌螯合物形成的影响,如图 1 所示。结果显示,随着酶解时间的延长,水解度先逐渐增加后趋于稳定,这符合酶解反应的趋势18;同时,肽对锌的螯合率随着酶解时间的延长,呈现先增长后下降的趋势,6h 酶解液对锌的螯合率最大(58.05%),显著高于其它时间点(P0.05)。天然蛋白质内部蕴藏着丰富的生理活性肽段,酶解处理可有效将这些肽段释放出来,而酶的种类及酶解时间等酶解条件,直接影响着肽的种类及数量,最终决定了酶解液对锌的螯合能力。碱性蛋白酶来源于枯草杆菌,作为一种丝氨酸内切酶,酶切位点广,被广泛用于金属螯合肽的制备19,因此本研究选择碱性蛋
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 蚕蛹 源肽锌 纳米 粒子 制备 及其 结构 表征
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。