采用GFP标记筛选抑制多血清型口蹄疫病毒3C基因表达的siRNA.pdf
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1、中国兽医杂志():采用 标记筛选抑制多血清型口蹄疫病毒 基因表达的 张志彬 张 健 贺 明 高倍瑶 贾 琪 张立春(吉林省农业科学院 吉林 公主岭 吉林农业大学动物科技学院 吉林 长春 延边大学农学院 吉林 延吉)摘要:为筛选出可抑制多种血清型口蹄疫病毒()的小干扰()本试验通过多血清型口蹄疫病毒序列比对与 设计分析筛选出潜在抗多血清型 位点通过体外合成 型、型和 型病毒部分基因序列制备绿色荧光蛋白()基因融合表达载体将化学合成的 与融合表达载体共转染通过 观察、和实时荧光定量反转录()方法检验目标 对融合基因的抑制效率 生物信息分析发现多血清型口蹄疫病毒 基因高度保守并存在潜在 作用靶位 融
2、合表达载体成功构建与化学合成的 共转染 细胞 观察发现 可有效抑制来源于 型、型和 型 基因的 荧光信号且持续时间达 检测证实此结果 检测发现 对 个 融合基因转录水平抑制效率超且作用可维持 本试验利用 作为筛选标记成功筛选出 个作用于 基因的 为开发多血清型口蹄疫抑制剂提供参考依据关键词:小干扰()口蹄疫()绿色荧光蛋白()多血清型 基因中图分类号:文献标志码:文章编号:()():()().().().:()()():收稿日期:基金项目:转基因生物新品种培育重大专项()吉林省自然科学基金()作者简介:张志彬()男助理研究员本科从事生猪遗传育种工作:通信作者:张立春:口蹄疫()是由口蹄疫病毒(
3、)引起的一种致偶蹄动物急性、热性、高度接触性传染病是世 界 动 物 卫 生 组 织()疫病名录收录的重要动物传染病之研 究 论 文 卷一同时位列我国农业农村部第 号公告所修定的一、二、三类动物疫病病种名录中一类传染病第 位 对世界畜牧经济具有巨大威胁素有“政治经济病”之称 由于 血清型、亚型众多各血清型/亚型间交叉免疫原性差 同时 作为小 病毒其基因组突变率高病毒流行株更迭迅速致使疫苗免疫预防策略并不能完全抑制 的暴发 干扰()作为新型病毒治疗策略在诸如乙型肝炎病毒()、丙型肝炎病毒()、人类免疫缺陷病毒()、新型冠状病毒()等病毒感染治疗中得到广泛应用研究表明采用 技术抑制 复制和增殖的效果
4、明显 但鉴于 血清型和基因型的复杂性通过设计少数小干扰()即达到抑制全部 分离株目标的技术难度较大 本试验通过对 数据库全部 分离株全基因组序列分析设计合成靶向 型、型和 型 基因保守区的采用绿色荧光蛋白()作为筛选标记成功筛选出 个能够快速且特异地抑制 种血清型 基因表达的为研制出高效、广谱的抗 的生物工程制剂提供科学依据 材料与方法 质粒、细胞和菌株质粒、细胞、大肠杆菌()菌株均由吉林省农业科学院动物生物技术研究所保存克隆载体 购自宝生物工程(大连)有限公司 酶类、试剂及仪器设备 连接酶、限制性内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司、脂 质 体()均 购 自 公司 凝胶回收试剂盒购自杭州维
5、特洁公司无内毒素质粒提取试剂盒购自 公司 荧光显微镜为 型荧光定量 仪为罗氏 型 多血清型 基因 的设计与合成 从 数据库中下载所有 型、型和 型 分离株的全基因组序列信息采用 软件进行序列同源比对分析遴选出各血清型所有 分离株基因组序列高度保守区域 以此区域作为潜在靶位采用 公司 在 线 设 计 软 件 (:/)设计出 条 命名为 同时设计随机(序列为)作为阴性对照 序列委托上海吉玛制药技术有限公司进行体外合成合成序列 末端添加 寡核苷酸 多血清型 基因的合成与 融合基因表达载体的构建 参照 型、型和 型 基因组保守区序列委托南京金唯智生物科技有限公司人工合成 型分离株/(登录号:)、型分离
6、株/(登录号:)和 型分离株 /(登 录 号:)基因片段长度为 合成片段两侧分别添加 和 酶切位点 双酶切处理 和 基因克隆质粒胶回收纯化后用 连接酶连接并进行转化 阳性克隆经酶切和测序鉴定以确定所构建的 表达载体的正确性 经鉴定正确的质粒采用无内毒素质粒提取试剂盒进行质粒提取 保存 和 共转染 细胞 采用脂质体转染法进行简要操作步骤:待 细胞生长至 后 孔板每孔加入质 粒 将 化 学 合 成 的 与 培养基 混合(终浓度为/)与 培养基 混合室温孵育 将上述两混合液混匀室温孵育 后滴加入转染孔转染后 更换培养液为完全培养液 同时设置不添加任何 的 载体作为空白对照组()添加 特异性 作为阳性
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