不同年期发酵床垫料细菌群落多样性及功能.pdf
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1、基金项目:陕西省县域重点科技项目()年延安市科技局园区与县域特色经济创新链项目()延安市生物资源开发与利用科技创新团队专项基金项目陕西省教育厅服务地方专项计划项目()作者简介:郑超超 女硕士研究生 从事微生物资源与利用和环境微生物学研究工作:.通讯作者 男教授博士硕士生导师 主要从事微生物资源与利用和环境微生物学研究工作:.收稿日期:不同年期发酵床垫料细菌群落多样性及功能郑超超 李买平 郝 雷 柳晓东 姜影影 贺晓龙 邓振山(.延安大学 生命科学学院陕西 延安.延安市宝塔区畜牧兽医中心陕西 延安)摘 要 探究不同年期发酵程度对发酵床垫料细菌群落多样性及功能的影响探究其中的有益微生物开发适合陕北
2、地区的发酵床专用菌剂 以铺设、和 年的发酵床垫料为研究对象新铺设的发酵床垫料作为对照()采用 高通量测序技术分别测定不同年期发酵床垫料细菌群落 基因 区序列并进行生物信息学分析 不同年期发酵床垫料获得 区 条有效序列聚成 种操作分类单元()分属于 个门 个纲 个目 个科和 个属其中厚壁菌门()和变形菌门()为发酵床垫料的主要优势菌门其占比为.其次为拟杆菌门()和放线菌门()其占比分别为.和.指数和 指数分别在.和.之间不同年期发酵床垫料细菌群落的丰度和多样性指数均高于对照且随着发酵年限的增加多样性与生长年期呈正相关致病细菌埃希氏菌属()及肠杆菌属()丰度和多样性指数下降趋势明显 优势细菌属数目
3、、组成及其丰度随发酵年限的不同而有所差异 短波单胞菌属()和芽胞杆菌属()的总丰度最高分别在.和.之间且优势细菌属中存在具有有益功能性状的微生物类群 群落功能预测分析初步显示不同年期的发酵床垫料细菌群落功能有所差异其中年限为 年的发酵床垫料微生物群落的功能信息最为丰富主要涉及到转运蛋白及磷酸转移酶系统功能其他年期主要体现在 转运蛋白、细菌分泌系统、细菌毒素类及调控系统等功能方面 不同年期发酵床垫料细菌群落组成和功能存在较大差异且发酵年限影响了发酵床垫料细菌群落多样性、群落结构及功能随着发酵年限的增加有益菌属丰度增加致病菌属丰度下降关键词 微生物发酵床不同年期发酵床垫料高通量测序细菌多样性功能预
4、测中图分类号 文献标识码 文章编号 ():./.(.)微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 .().().我国畜禽废物年总量高达 亿 是工业废弃物的.倍 畜禽废物除了污染土壤、水体外还会产生大量的臭味气体如氨气、硫化氢、硫醇和甲硫醇等产生了养殖粪污堆积等问题给环境及人畜的正常生活带来不利的影响 微生物发酵床技术是一种绿色养殖方式通过分解消纳粪污符合环保要求且利于家禽生长 发酵床养殖模式是一种环境友好的动物养殖技术以木屑、稻壳、秸秆等农业废弃物为发酵床垫材料添加微生物复合菌降解粪污减少对环境的污染改善畜禽的生存环境 发酵床养猪模式的发展不仅提升了养殖的经济效益促进养殖产业生产能力及市场竞争力同时解
5、决了粪污堆积、环境污染及生猪健康养殖等问题 微生物发酵床技术已列入国家重点环境保护应用技术中对于解决畜禽粪便的污染问题具有很好的推广价值 目前我国大部分发酵菌剂引进于国外这与我国的养殖环境不相协调菌剂微生物很难竞争过原有的土著微生物发挥不了改良调节的作用等有些菌剂如 已经被应用于发酵床但是针对性不强成本也相对较高 因此发酵菌剂的研究势在必行 但引进发酵技术的同时却忽略了对发酵床菌剂的改进研究 由于不同环境下微生物的生长情况和代谢特性存在很大的差异引进的发酵菌种往往在生产过程中出现各种问题导致发酵床养殖成本升高、利润降低甚至死床已经成为该技术发展的瓶颈问题 目前国内专门应用于发酵床的菌剂很少菌剂
6、品质也良莠不齐 因此发酵床垫料中存在的微生物是发酵床运行的核心其微生物的种类及数量对发酵床功能的正常发挥及养殖动物的健康至关重要 发酵床中细菌种类丰富研究发酵床中蕴含的微生物群落可累积丰富的微生物资源 由于发酵床的正常运行和功能发挥与其发酵床垫料中的相关微生物种类息息相关因此研究发酵床垫料微生物组成与结构具有重要意义 影响发酵床中微生物多样性因素众多柳晓波等研究发现与传统的水泥地养殖相比发酵床养殖技术可提供稳定而丰富的菌群和 期 郑超超等:不同年期发酵床垫料细菌群落多样性及功能 稳定的温湿度有利于猪仔生存 不同深度和不同发酵程度发酵床垫料的微生物组成水平也存在差异 常见的发酵床垫料的优势菌属有
7、节杆菌属()、芽胞杆菌属()、梭菌属()及肠杆菌属()目前已有研究表明发酵床中的微生物随着发酵床垫料使用时间而发生变化 发酵床技术的应用给养殖业带来了前所未有的发展但由于不同地区环境存在差异目前关于时间间隔较长且环境温差较大的陕北地区发酵床养殖及相关发酵床专用菌剂研制鲜有报道且不同时段的发酵床垫料中细菌多样性变化对陕北地区生猪养殖具有启发意义 综上所述开发陕北地区本土化复合发酵菌剂建立微生物发酵床实现对畜禽废物的原位处理减少排放能在一定程度上降低生产成本取得较好的环境和经济效益 鉴于此本研究针对生猪养殖过程中造成严重污染和副产物资源化问题围绕养殖污染微生物治理、微生物资源筛选通过从陕北地区养殖
8、场以及周边分离筛选出适合养殖环境、性能优良的菌株使之在畜禽粪便中充分生长繁殖形成优势菌群形成发酵床复合菌剂 本研究选取延安市宝塔区通过发酵床技术养猪场铺设、和 年的发酵床垫料为研究对象新铺设的发酵床垫料作为对照()采用 高通量测序技术分析不同年期发酵床垫料细菌群落组成变化及其相互关系以开发其中蕴含的有益微生物资源为适合陕北地区的发酵床专用菌剂的研制、发酵床垫料的维护及养殖粪污降解等方面提供参考 材料与方法.材料.研究区概况 样品采自延安市宝塔区姚店镇小张沟村()一家大型现代化养猪场该养猪场于 年从福建省农业科学院引进发酵床养猪技术可为本研究提供充足的不同年限的发酵床垫料来源 采样点地处暖温带温
9、和半湿润气候区年平均温度.一月平均气温 .七月平均气温.极端最高气温.极端最低气温.最热月份平均相对湿度 年日照 年降水量 集中在 月.样品采集与处理样品采集于 年 月 日新铺设的发酵床垫料作为对照()试验组发酵年限分别为一年(年期)、两年(年期)、三年(年期)和四年(年期)的发酵床垫料 通过五点采样法采集样品其中每一样点采集 个不同深度(、)发酵床垫料样品混合每个样点采集重量为 共 最后将五个样点采集的发酵床垫料混合为一个样品共计 一个年份采集 个样品共采集 个发酵床垫料样品 分装于灭菌的自封袋中低温保存运回实验室于 保藏用于土壤微生物 的提取及后续测试.主要试剂与仪器设备 型 抽提试剂盒(
10、)琼脂糖凝胶()聚合酶()胶回收试剂盒()电泳 仪(北 京 市 六 一 仪 器 厂 )型 仪()测序仪()微型离心机(合肥艾本森科学仪器有限公司)小型离心机()粉碎研磨仪(上海万柏生物科技有限公司).方法.基因组 的提取及扩增测序 离心管中加入.发酵床垫料根据磁珠法土壤和粪便基因组 提取试剂盒(中国)说明书进行总 提取 应用 及 琼脂糖凝胶电泳(电压 /)进行 纯度、浓度检测及 完整性检测 采用 ()和()引物扩增细菌 基因 区 每个样本个 重复将 个重复的 产物混合使用琼脂糖凝胶电泳检测产物 利用 胶回收试剂盒对 产物纯化 对其进行检测定量 根据、标准操作规程将纯化后的扩增片段构建 的文库
11、利用 公司的 平台进行测序 微 生 物 学 杂 志 卷.数据处理、发酵床垫料细菌群落多样性分析及功能预测 用 软件中插件()对所有样品的全部原始序列()进行质量控制修剪、去噪、拼接、去嵌合体 形成特征表格 使用 软件(.:/./)根据 的相似度对序列进行 聚类应用 软件剔除嵌合体得到 代表序列选出与 代表序列相似性在 以上的序列生成 表格 利用 (:/./)对每条序列进 行 物 种 分 类 注 释 比 对 数 据 库()设置比对阈值为 根据每个 中序列的条数获其 的丰度值 选取物种绝对丰度前 进行优势物种分类 进行样品组间和组内共有及特有 数目分析、物种组成及物种差异性分析 应用 插件计算多样
12、性矩阵 多样性分析应用、和 指数评估样本本身的多样性程度 多样性指数应用 距离进行主坐标分析()评估样本之间的微生物群落结构差异性 应用 软件预测微生物群体可能的功能组成 使用.软件进行单因素方差分析并利用 法进行差异显著性检验 结果与分析.不同年期发酵床垫料细菌 及其多样性分析经质量控制、去噪、拼接与去嵌合体(表)共获得 条序列、种 年期、年期、年期、年期及对照组有效序列均值分别为、及 其中最小值为()最大值为()样品有效序列表明不同年期发酵床垫料微生物组成有差异 特征序列数量最大为 年期分别为 年期、年期和 年期的.倍、.倍和.倍 四个年期发酵床垫料含量均高于对照组表明发酵床垫料使用年期可
13、影响其细菌多样性 样品 范围在 ()()之间 年期 数目最多 稀释曲线(图)显示所有样品随着序列数量的增加所观察到的 数量逐渐趋于平缓达到饱和 说明随着测序深度增加获得的新物种不会显著增加即测序获得的数据量合理能反映绝大多数的细菌信息图 基于 指数分析的各样品稀释曲线图.表 发酵床垫料细菌多样性测序结果分析 样本有效序列相似性分析条件 .注:表中同一行不同字母标记表示差异显著性(.)通过多样性指数分析表 结果表明各样品均 衡 度 较 好 其 中指 数 范 围 在()()指数范围在 ()()之间 年期 和 指数较高发酵床垫料细菌丰度最高其次为 年期 指数范围在().()指数范围在 ().()根据
14、 指数和 指数反应样品细菌群落丰度其中 年期指数最高 年期指数最低均高于对照组其 和 指数分别为.和 结果表明发酵床垫料中 年期细菌丰度最高 年期最低 此外四个年期各指数明显高于对照组使用后的发酵床垫料细菌群落丰度高 期 郑超超等:不同年期发酵床垫料细菌群落多样性及功能 于原始发酵床垫料细菌丰度.不同年期发酵床垫料细菌种群归类分析共检测到 门 纲 目 科 属和 种细菌 共有物种 种特有物种中 年期 为 种 年期 种 年期 种 年期 种对照组 种 共有物种分别隶属于变形菌门()、厚壁菌门()和拟杆菌门()变形菌门主要含 个属:短波单胞菌属()、无色杆菌属()、苍白杆菌属()和一未知属厚壁菌门 个
15、属:芽胞杆菌属()、赖氨酸芽胞杆菌属()及一未知属拟杆菌门 个属鞘氨醇杆菌属()及一未知种 随着发酵床垫料使用时间延长细菌特征种类也发生了变化从 年期的 种到使用两年后增加到 种三年后显著减少到 种第四年闲置后上升到 种(图)图 样品共有及特有物种组成分析.不同年期发酵床垫料细菌门及科水平的优势种群分析门分类水平微生物群落结构组成分析如图 所示对照组优势菌门为厚壁菌门(.)其次为变形菌门(.)存在少量拟杆菌门实验组中主要为厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门 其中 年期发酵床垫料厚壁菌门(.)和变形菌门(.)占主导地位含少量拟杆菌门(.)和放线菌门(.)年期细菌群落与 年期相比数量增加且结构
16、更为复杂其中变形菌门、拟杆菌门.、厚壁菌门.及放线菌门.并出现绿弯菌门()和疣微菌门(.)年期中细菌群落显著减少 其中变形菌门()及厚壁菌门(.)为优势门 年期 发 酵 床 垫 料 出 现 新 分 类 群:疣 微 菌 门(.)、蓝细菌门()与芽单胞菌门()变形菌门(.)与拟杆菌门(.)为优势类群含部分厚壁菌门()与放线菌门(.)总体变化为:年期和 年期细菌群落丰度大于 年期和 年期其中厚壁菌门在初始发酵床垫料中的含量随使用时间的增长显著降低 年期时降低到(相对含量降低.)变形菌门群落结构与厚壁菌门呈相反趋势初始发酵床垫料使用至 年期时变形菌门增加.且 年期细菌群落结构趋于复杂 拟杆菌门在 年期
17、、年期和 年期中较稳定存在在对照组中仅有少部分存在 结果表明在不同时期发酵床垫料细菌群落有差异(图)在门群落水平上有三个未明确分类的细菌差异显著说明发酵床垫料中含有未被发掘的微生物资源图 不同年期发酵床垫料物种组成分析(门水平).()微 生 物 学 杂 志 卷在科水平细菌群落组成中对照组主要包括链球菌科()和乳酸杆菌科()四个不同年期发酵床垫料主要含有芽胞杆菌科()、柄杆菌科()、布鲁氏菌科()、鞘脂杆菌科()、产碱杆菌科()、丛毛单胞菌科()和红杆菌科()初始发酵床垫料使用一年后(年期)细菌群落结构发生变化由初始发酵床垫料中的链球菌科(.)和猪皮杆 菌 科(.)演 替 为 芽 胞 杆 菌 科
18、()、柄杆菌科(.)、布 鲁 氏 菌 科()、鞘脂杆菌科(.)和产碱杆菌科()年期主要为柄杆菌科(.)、布鲁氏菌科(.)、鞘脂杆菌科(.)、芽胞杆菌科(.)、丛毛单胞菌科(.)和红杆菌科()年期发酵床垫料主要有芽胞杆菌科(.)、柄杆菌科(.)、布鲁氏菌科(.)、鞘脂杆菌科(.)和产碱菌科(.)年期发酵床垫料优势科群落与 年期一致其中柄杆菌科(.)和鞘脂杆菌科(.)含量增加芽胞杆菌科(.)、布鲁氏菌科(.)和产碱杆菌科(.)减少 年期中芽胞杆菌科(.)含量显著降低于 年期中再次增加在 年期时含量下降为.结果表明不同使用期限的发酵床垫料细菌组成呈现曲线变化主要细菌丰度有差异(图)图 不同年期发酵床
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