SOCS6通过JAK2_STAT3信号通路对人牙周膜成纤维细胞炎症及凋亡的影响.pdf
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1、基金项目 佛山市科技创新项目(编号:2 2 2 0 0 0 1 0 0 5 5 5 3)作者简介 邱枫(1 9 8 0),女,山东梁山人,副主任医师,学士,主要从事牙周病学研究。*通信作者 邱枫,E-m a i l:q f 8 0 1 1 2 31 6 3.c o mS O C S 6通过J A K 2/S T A T 3信号通路对人牙周膜成纤维细胞炎症及凋亡的影响邱枫1*杜宇1 罗惠冰1 刘星21.佛山市禅城区人民医院口腔综合科 广东 佛山 5 2 8 0 0 0;2.井冈山大学医学部 江西 吉安 3 4 3 0 0 9 摘要 目的:探究S O C S 6通过J AK 2/S TA T 3信
2、号通路对人牙周膜成纤维细胞(h P D L F s)炎症及凋亡的影响。方法:取对数生长期的h P D L F s,分组如下:对照组、0.1 m g/L L P S组、1 m g/L L P S组、5 m g/L L P S组,q R T-P C R观察L P S对h P D L F s中S O C S 6 mR NA表达的影响,W e s t e r n b l o t观察L P S对h P D L F s中S O C S 6蛋白表达的影响,C C K-8法观察L P S对h P D L F s细胞活力的影响,E L I S A法观察L P S对h P D L F s细胞炎症因子T N F-、
3、I L-1的含量的影响。慢病毒滴度检测、靶细胞感染预实验及细胞转染,并且q R T-P C R检测细胞S O C S 6 mR NA表达。取对数生长期的h P D L F s,过表达转染S O C S 6后,L P S诱导h P D L F s炎症细胞模型,用J AK 2信号激活剂香豆霉素A 1(C A 1)处理过夜,分组如下:L P S组(5 m g/L L P S)、L P S+o e-N C组、L P S+o e-S O C S 6组、L P S+o e-S O C S 6+C A 1组,C C K-8法检测各组细胞活力,流式细胞术检测各组细胞凋亡,E L I S A法检测细胞炎症因子T
4、N F-、I L-1的含量,W e s t e r n b l o t检测细胞S O C S 6、p-J AK 2、p-S TA T 3蛋白表达。结果:S O C S 6在h P D L F s细胞表达,随着L P S刺激,S O C S 6基因表达下调,并且L P S浓度越高,细胞中S O C S 6基因表达下调越明显。而且,h P D L F s细胞过表达S O C S 6基因后,p-J AK 2、p-S T A T 3蛋白表达明显降低,细胞炎症因子T N F-、I L-1含量减少,凋亡率下降。结论:S O C S 6在L P S诱导的牙周炎细胞模型中表达下调,过表达S O C S 6后细
5、胞活力显著升高,凋亡率降低,此作用可能与抑制 J AK 2/S TA T 3信号通路及炎症因子I L-1、T N F-的表达有关。关键词 细胞因子信号传导抑制因子6;J AK 2/S TA T 3信号通路;人牙周膜成纤维细胞;T N F-;I L-1 文献标识码 A 文章编号 1 6 7 17 6 5 1(2 0 2 3)0 90 8 1 50 6d o i 1 0.1 3 7 0 1/j.c n k i.k q y x y j.2 0 2 3.0 9.0 1 0E f f e c t s o f S O C S 6 o n I n f l a mm a t i o n a n d A p o
6、 p t o s i s o f H u m a n P e r i o d o n t a l L i g a m e n t F i b r o b l a s t s t h r o u g h J A K 2/S T A T 3 S i g n a l i n g P a t h w a y.Q I U F e n g1*,DU Y u1,L U O H u i b i n g1,L I U X i n g2.1.D e p a r t m e n t o f G e n e r a l D e n t i s t r y,F o s h a n C h a n c h e n g P
7、 e o p l es H o s p i t a l,F o s h a n 5 2 8 0 0 0,C h i n a;2.S c h o o l o f M e d i c i n e,J i n g g a n g s h a n U n i v e r s i t y,J i a n 3 4 3 0 0 9,C h i n a.A b s t r a c t O b j e c t i v e:T o e x p l o r e t h e e f f e c t s o f S O C S 6 o n i n f l a mm a t i o n a n d a p o p t o
8、 s i s o f h u m a n p e r i o d o n t a l l i g a-m e n t f i b r o b l a s t s(h P D L F s)t h r o u g h J AK 2/S TA T 3 s i g n a l i n g p a t h w a y.M e t h o d s:h P D L F s i n t h e l o g a r i t h m i c g r o w t h p h a s e w e r e d i v i d e d i n t o t h e f o l l o w i n g g r o u p s
9、:c o n t r o l g r o u p,0.1 m g/L L P S g r o u p,1 m g/L L P S g r o u p,a n d 5 m g/L L P S g r o u p.q R T-P C R w a s u s e d t o o b s e r v e t h e e f f e c t o f L P S o n t h e e x p r e s s i o n o f S O C S 6 mR NA i n h P D L F s,W e s t e r n b l o t w a s u s e d t o o b s e r v e t h
10、 e e f f e c t o f L P S o n t h e e x p r e s s i o n o f S O C S 6 p r o t e i n i n h P D L F s,C C K-8 w a s u s e d t o o b s e r v e t h e e f f e c t o f L P S o n t h e c e l l v i a b i l i t y o f h P D L F s,a n d E L I S A w a s u s e d t o o b s e r v e t h e e f f e c t s o f L P S o n
11、 t h e i n f l a mm a t o r y f a c t o r s T N F-a n d I L-1 o f h P D L F s.T h e l e n t i v i r u s t i t e r,p r e-e x p e r i m e n t o f t h e t a r g e t c e l l i n f e c t i o n,a n d c e l l t r a n s f e c t i o n w e r e d e t e c t e d,a n d S O C S 6 mR NA e x p r e s s i o n w a s d
12、e t e c t e d b y q R T-P C R.h P D L F s i n t h e l o g a r i t h m i c g r o w t h p h a s e w e r e t r a n s f e c t e d w i t h o v e r e x p r e s s e d S O C S 6.A n i n f l a mm a t o r y c e l l m o d e l o f h P D L F s w a s t h e n i n d u c e d b y L P S a n d t r e a t e d o v e r n i
13、 g h t w i t h t h e J AK 2 s i g n a l a c t i v a t o r c o u m e r m y c i n A 1(C A 1).T h e g r o u p s w e r e a s f o l l o w s:L P S g r o u p(5 m g/L L P S),L P S+o e-N C g r o u p,L P S+o e-S O C S 6 g r o u p,a n d L P S+o e-S O C S 6+C A 1 g r o u p.C C K-8 w a s u s e d t o d e t e c t
14、c e l l v i a b i l i t y i n e a c h g r o u p,f l o w c y t o m e t r y w a s u s e d t o d e t e c t c e l l a p o p t o s i s i n e a c h g r o u p,E L I S A w a s u s e d t o d e t e c t t h e c o n t e n t s o f i n f l a mm a t o r y f a c t o r s T N F-a n d I L-1,a n d W e s t e r n b l o t
15、 w a s u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n o f S O C S 6,p-J AK 2,a n d p-S TA T 3 p r o t e i n s.R e s u l t s:518 口腔医学研究2 0 2 3年9月第3 9卷第9期S O C S 6 w a s e x p r e s s e d i n h P D L F s.W i t h L P S s t i m u l a t i o n,S O C S 6 g e n e e x p r e s s i o n w a s d o w n-r e g u
16、 l a t e d,a n d t h e h i g h e r t h e c o n c e n t r a t i o n o f L P S,t h e m o r e o b v i o u s t h e d o w n-r e g u l a t i o n o f S O C S 6 g e n e e x p r e s s i o n i n c e l l s.M o r e o-v e r,a f t e r o v e r e x p r e s s i o n o f S O C S 6 g e n e i n h P D L F s,t h e p r o t
17、 e i n e x p r e s s i o n o f p-J AK 2 a n d p-S TA T 3 d e c r e a s e d o b v i o u s l y,t h e c o n t e n t s o f i n f l a mm a t o r y f a c t o r s TN F-a n d I L-1 d e c r e a s e d,a n d t h e a p o p t o s i s r a t e d e c r e a s e d.C o n c l u s i o n:T h e e x p r e s s i o n o f S O
18、 C S 6 i s d o w n-r e g u l a t e d i n L P S-i n d u c e d p e r i o d o n t i t i s c e l l m o d e l,a n d t h e c e l l v i a b i l i-t y i s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d a n d t h e a p o p t o s i s r a t e i s d e c r e a s e d a f t e r o v e r e x p r e s s i o n o f S O C S
19、 6,w h i c h m a y b e r e l a t e d t o t h e i n h i b i t i o n o f J AK 2/S TA T 3 s i g n a l i n g p a t h w a y a n d t h e e x p r e s s i o n o f i n f l a mm a t o r y f a c t o r s I L-1 a n d T N F-.K e y w o r d s S O C S 6;J AK 2/S TA T 3 s i g n a l i n g p a t h w a y;h u m a n p e r
20、 i o d o n t a l l i g a m e n t f i b r o b l a s t s;T N F-;I L-1 作为成年人牙齿松动和脱落的主要原因1,牙周炎被认为是世界上最常见和最严重的口腔疾病之一。文献表明,炎症是牙周炎发生和发展的关键因素之一,促炎细胞因子在细菌刺激和组织破坏中起着重要作用2。细胞因子信号传导抑制因子6(s u p p r e s s o r o f c y t o k i n e s i g n a l i n g 6,S O C S 6)属于S O C S家族,主要负责调节受体酪氨酸激酶信号3。已有研究表明,S O C S 6在牙周炎中表达下调,
21、S O C S 6参与脂多糖(l i p o p o l y s a c c h a r i d e,L P S)刺激下的牙周韧带细胞损伤4。S O C S 6敲低可消除牙周炎细胞凋亡和炎症5。相关文献在心肌细胞中也证明了m i R-1 9 b对S O C S 6表达水平的调节作用6。但S O C S 6影响牙周炎的具体机制仍未明确。同时,X i a o等7在高糖条件下人视网膜微血管内皮细胞中证明了存在m i R-1 9 b/S O C S 6/J AK 2/S T AT 3的 信 号 轴 调 控 细胞凋亡和炎症。而且S T AT 3对炎症进展的调节在很多类型的疾病均有报道8。因此,对炎症的调
22、控可能 是S T AT 3影 响 牙 周 炎 的 可 能 机 制。推 测S O C S 6通过J AK 2/S T AT 3信号通路调节牙周炎的发生发展。1 材料与方法1.1 材料 人牙周膜成纤维细胞(h u m a n p e r i o-d o n t a l l i g a m e n t f i b r o b l a s t s,h P D L F s)(货 号:C P-H 1 3 6)购自武汉普诺赛生命科技有限公司;L P S(货号:L 8 8 8 0)购 自 北 京 索 莱 宝 科 技 有 限 公 司;F a s t K i n g一步法除基因组c D NA第一链合成预混试剂(货
23、号:K R 1 1 8-0 2)、无内毒素质粒小提中量试剂盒(货号:D P 1 1 8-0 2)、普通D NA产物纯化试剂盒(货号:D P 2 0 4-0 2)购自天根生化科技(北京)有限公司;R I P A裂 解 液(货 号:P 0 0 1 3 B)、PM S F(1 0 0 mm o l/L)(货号:S T 5 0 6)、B C A蛋白浓度测定试剂盒(货 号:P 0 0 1 0 S)、预 染 蛋 白 质 分 子 量 标 准(1 91 1 7 k D)(货号:P 0 0 6 6)、P B S(货号:C 0 2 2 1 A)、P V D F膜(货号:F F P 2 4)、S D S-P AG
24、E蛋白上样缓冲液(货号:P 0 0 1 5 A)、A n n e x i n V-F I T C细胞凋亡检测试剂 盒(货 号:C 1 0 6 2 S)、C C K-8试 剂 盒(货 号:C 0 0 3 7)、人白细胞介素-1(I L-1)E L I S A试剂盒(货号:P I 3 0 5)购自上海碧云天生物技术有限公司;人肿瘤坏 死 因 子-(T N F-)E L I S A试 剂 盒(货 号:m l 0 6 4 3 0 3)购自上海酶联生物科技有限公司;A n t i-S O C S 6抗 体(兔 多 克 隆 抗 体)(货 号:a b 1 9 7 3 3 5)、A n t i-GA P DH
25、抗 体(兔 单 克 隆 抗 体)(货 号:a b 1 8 1 6 0 2)、山 羊 抗 兔I g G H&L(HR P)(货 号:a b 6 7 2 1)购自A b c a m公司;p-J AK 2兔单克隆抗体(货号:#4 4 0 6)、p-S T AT 3兔单克隆抗体(货号:#4 9 0 8 1)购自C S T公司;香豆霉素A 1(c o u m e r m y c i n A 1,C A 1)(货号:HY-N 7 4 5 2)购自MC E公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养 h P D L F s在含1 0%胎牛血清、1 0 0 g/m L链霉素和1 0 0 U/m L青霉素的DMEM培
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