阿魏酸钠通过miR-216b-3p_Nrf2通路减轻缺氧缺血胚胎大鼠氧化应激反应.pdf
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1、神经解剖学杂志2023,39(5):529 536Chinese Journal of Neuroanatomy阿魏酸钠通过miR-216b-3p/Nrf2通路减轻缺氧缺血胚胎大鼠氧化应激反应黄一伟12,部萌,牟宸希,徐伟靖”,孙逊,陈天浩,徐辉1,2*(佳木斯大学:1.基础医学院;2.微生态-免疫调节网络与相关疾病重点实验室;3公共卫生学院,佳木斯1540 0 7)摘要】目的:探究阿魏酸钠(SF)通过miR-216b-3p/Nrf2 通路对缺氧缺血性脑病(HIE)胚胎大鼠大脑的干预作用以及减轻氧化应激损伤的作用机制。方法:将成年雌性SD大鼠和雄鼠,按照3:1比例合笼获得怀孕的雌鼠。然后将孕鼠
2、分为假手术组(sham)、缺氧缺血性脑病模型组(HIE)、SF低剂量组(HIE+SF-L)和SF高剂量组(HIE+SF-H)。通过无创止血钳夹闭子宫两侧动脉和卵巢血管法制备胚胎大鼠HIE模型。SF治疗组腹膜腔注射SF。采用HE染色观察胚胎大鼠大脑皮质的病理变化;免疫荧光观察核因子红细胞系2 相关因子2(Nr f 2)、过氧化还原酶1(PRDX1)的表达情况;WestermBlot检测胚胎大鼠脑组织中Nrf2和PRDX1蛋白的表达;real timeRT-PCR检测miR-216b-3p的表达以及Nrf2和PRDX1的mRNA表达;WST-8法和TBA法检测脑组织中的超氧化物歧化酶(SOD)活性
3、和丙二醛(MDA)含量。结果:与sham组对比,HIE组胚胎大鼠的大脑损伤加重,病理改变明显;HIE组中Nrf2蛋白表达和mRNA水平降低(P0.05),PR D X1的蛋白水平和mRNA水平显著上调(P0.05),mi R-2 16 b-3p 表达水平显著升高(P0.05);并且Nrf2的平均荧光强度显著降低(P0.05),PRDX1的平均荧光强度显著增加(P0.05);SO D 活性显著下调,MDA含量显著增加(P0.05)。与HIE组对比,各剂量SF组的大脑皮质病理结构明显改善,脑损伤减轻;Nrf2和PRDX1的蛋白表达、mRNA水平以及平均荧光强度均显著上升(P0.05);mi R-2
4、 16 b-3p 表达水平均显著下调,以SF高剂量组下调最为显著(P0.05);并且SOD活性显著上调,MDA含量显著下调(P0.05)。结论:SF通过miR-216b-3p/Nrf2信号通路在HIE的发生发展过程中发挥重要作用,并减轻胚胎大鼠受到的氧化应激损伤。【关键词阿魏酸钠;缺氧缺血性脑病;氧化应激;核转录因子红系2 相关因子2;过氧化物还原蛋白1;大鼠D0I;10.16557/ki.1000-7547.2023.05.005Sodium ferulate attenuates oxidative stress reaction via miR-216b-3p/Nrf2pathway i
5、n hypoxic-ischemi embryonic ratsHUANG Yiwei-,GAO Meng,MU Chenxi,XU Wejing,SUN Xu,CHEN Tianhao,XU Huil.2*(Jiamusi University:1.School of Basic Medicine;2.Key Laboratory of Microecology-Immune RegulationNetwork and Related Diseases;3.College of Public Health,Jiamusi 154007,China)Abstract Objective:To
6、Investigate the interventional effects of sodium ferulate(SF)on the brain of hypoxic-ischemic encephalopathy(HIE)embryonic rats via miR-216b-3p/Nrf2 pathway and the mechanism of action of SF inreducing oxidative stress damage.Method:Adult female SD rats and male rats were caged together in a 3:1 rat
7、io toobtain Pregnant female rats.The pregnant rats were then divided into sham group(sham),model group(HIE),SF low-dose group(HIE+SF-L)and an SF high-dose group(HIE+SF-H).The HIE model was prepared by non-invasivehemostatic forceps clamping the arteries on both sides of the uterus and the ovarian ve
8、ssels.SF was injected intraperito-neally into the SF treatment group.HE staining was used to observe the pathological changes in the cerebral cortex of基金项目:黑龙江省教育厅基本科研业务费基础研究项目(2 0 19-KYYWF-1337)*通信作者:徐辉电话:1394546 590 3,E-mail:x u h u i 197 8 2 0 0 3 16 3.c o m530embryonic rats;immunofluorescence wa
9、s used to observe the expression of nuclear factor-erythroid 2-related factor 2(Nr2),and peroxiredoxin 1(PRDX1);Western Blot detection of Nrf2,and PRDX1 protein expression in embryonicrat brain tissue;real time RT-PCR to detect the expression of miR-216b-3p and the mRNA expression of Nrf2 andPRDXI;d
10、etermination of superoxide dismutase(SOD)activity and malondialdehyde(MDA)content in brain tissue byWST-8 and TBA methods.Results:Compared with the Sham group,the embryonic rats in the HIE group showed in-creased brain damage and significant pathological changes;Nrf2 was significantly down-regulated
11、 in protein level andmRNA level in the HIE group(P0.05),PRDX1 was significantly up-regulated in protein level and mRNA level(P0.05),and miR-216b-3p expression levels were significantly increased(P0.05);and the average fluorescenceintensity of Nrf2 was significantly decreased(P0.05)and the mean fluor
12、escence intensity of PRDX1 was significantlyincreased(P0.05);SOD activity was significantly down-regulated and MDA content was significantly increased(P0.05).Compared with the HIE group,the cortical pathological structure was significantly improved and brain damagewas reduced in the SF group at all
13、doses;and protein expression,mRNA levels and mean fluorescence intensity of Nrf2and PRDX1 were significantly increased(P0.05);miR-216b-3p expression levels were significantly down-regulated,with the most significant down-regulation in the SF high-dose group(P0.05);And SOD activity was significantly
14、up-regulation and MDA content was significantly down-regulation(P0.05).Conclusion:SF plays an important role inthe development of HIE through miR-216b-3p/Nrf2 signaling pathway and reduces oxidative stress damage in embryonicrats.Key words s缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopa-thy,HIE)是新生儿受到围产期室息后由于
15、脑部血氧输送障碍,引发的一种不可逆的缺氧缺血性脑损伤。宫内窘迫是导致新生儿缺氧缺血性脑损伤的主要原因,是指胎儿宫内缺氧导致胎儿酸中毒、神经系统受损,严重时出现后遗症甚至胎儿死亡2.3OHIE发生后,由于机体受到缺氧/缺血应激,细胞受损引发不同miRNA表达的失调,造成神经元永久损伤4。一些miRNA被认为是缺氧条件下的损伤因子,能促进细胞炎症、线粒体功能障碍、氧化应激和凋亡5。它们能够调节靶蛋白的合成,miRNA-mRNA信号通路成为限制脑缺血事件后神经元损伤的一种可能的治疗策略。核转录因子红系2 相关因子 2(nuclear factor-erythroid 2-related factor
16、 2,Nrf2)在缺氧缺血性脑损伤中的作用受到广泛关注6,7 。相关研究显示氧化应激发生后,Nrf2 从胞质穿过核膜进人细胞核,与核内的小Maf 蛋白(small Maf pro-teins,s M a f)形成异源二聚体,再与抗氧化反应元件(a n t i o x i d a n t r e s p o n s e e l e m e n t,A R E)相互结合能激活下游抗氧化基因血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、过氧化物还原酶1(peroxiredoxin1,PRDX1)的转录8 。阿魏酸钠(sodium ferula
17、te,SF)是一种抗氧化药物,它具有酚羟结构,在氧化应激反应中发挥重要的抗氧化作用9。然而,SF抑制HIE发生后的氧化应神经解剖学杂志,2 0 2 3年9月第39卷第5期sodium ferulate(SF);hypoxic-ischemic encephalopathy(HIE);oxidative stress;nuclear factor-ery-throid 2-related factor 2(Nrf2);peroxiredoxin 1(PRDX1);rat1.1实验动物SPF级SD大鼠共15只购于辽宁长生生物技术股份有限公司,在佳木斯大学实验动物中心进行适应性饲养和取材实验,其中雌
18、鼠10只,雄鼠5只,初始体重在18 0 2 2 0 g,无交配史。实验单位使用许可证编号:SYXK(黑)2 0 2 1-0 18。实验程序获得佳木斯大学伦理委员会批准。1.2药品、试剂和仪器阿魏酸钠粉末(纯度:98%)购自上海源叶公司。苏木精-伊红染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,兔抗Nrf2多克隆抗体、兔抗PRDX1多克隆抗体、兔抗GAPDH多克隆抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司,辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,H R P)标记羊抗兔多克隆二抗购自武汉博士德生物工程有限公司,RIPA裂解液购自大连美仑生物技术有限公司,miR-cute miRNA提取分
19、离试剂盒和miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRNA荧光定量试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司,U6引物购自生工生物工激反应的作用机制暂不明确,本研究基于miR-216b-3p/Nrf2通路探究胚胎大鼠发生宫内窘迫前施加SF干预,对胚胎大鼠大脑的保护作用及 SF的抗氧化应激损伤的作用机制。材料与方法1.材料黄一伟:阿魏酸钠通过miR-216b-3p/Nrf2通路减轻缺氧缺血胚胎大鼠氧化应激反应程(上海)股份有限公司,miR-216b-3p引物购自北京睿博兴科生物技术有限公司,总RNA提取试剂和SOD试剂盒均购自合肥白鲨生物Nrf2、PR D X1和GAPDH引物均购自生工生物工程(
20、上海)股份有限公司,MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所,反转录试剂盒和qPCRMasterMix试剂盒均购自赛文创新(北京)生物科技有限公司。反转录PCR仪和转印电泳仪均购自美国Bio-Rad公司,荧光定量PCR扩增仪购自美国应用生物系统公司,多功能酶标仪购自美国BioTek仪器有限公司,蛋白电泳仪购自北京六一生物科技有限公司,荧光显微镜购自德国Leica公司,超微量分光光度仪购自美国Ther-moFisher科技公司。2.方法2.1模型制备参考国内外文献中的造模方法10.11,术前 10 12 h 将妊娠 19 d 的雌鼠单独隔离并禁食,正式手术前应安抚孕鼠,尽量减少应激反应。采用戊巴比
21、妥钠35mg/kg腹膜腔麻醉,将其四肢固定于手术台上。用剪刀行正中切口沿腹部中线逐层剪开肌肤,打开腹腔暴露出子宫及卵巢血管。用两个无创止血钳分别钳夹两侧子宫动脉和卵巢血管并计时,使胚胎大鼠发生宫内窘迫。10 min后去除止血钳夹恢复子宫的血流供给。用碘伏消毒腹部切口部位,将子宫和腹腔器官放回,并用2-0 号缝合线逐层缝合腹部伤口,最后再用碘伏消毒表面缝合好的伤口,待苏醒后放回笼中单独饲养。关腹6 h后,麻醉孕鼠,按照原切口逐层剪开,暴露出子宫,可以观察到胚胎大鼠脐带血管及子宫动脉内血流清晰视为造模成功,取胚胎大鼠的脑组织保存于液氮中。2.2分组给药将孕19 d的雌鼠,按处理方式不同编号后分为s
22、ham组、HIE组、HIE+SF-L组和HIE+SF-H组,每组3 只。sham 组和 HIE组于相同时间注射等量的生理盐水。HIE+SF-L组和HIE+SF-H组于怀孕12 d起,开始腹腔注射2 5mg/kg和100 mg/kg的 SF,为期一周直至术前30 min 注射最后一次。2.3HE染色含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液固定脑组织2 4h后,进行脱水、包埋、切片等操作,厚度为4 m。然后于6 5条件下烤片,二甲苯和酒精脱蜡,再用苏木精溶液染色,三蒸水洗涤后经盐酸分化,氨水反蓝,用伊红溶液染色,再用无水乙醇和二甲苯脱水,最后中性树胶封片,于光学显微镜下观察大脑病理形态并拍摄图像。2.4生物信息
23、学预测靶基因531miRDB和miRanda数据库,预测miR-216b-3p的下游靶基因。2.5Western Blot称取10 0 mg左右的脑组织用RIPA裂解液提取总蛋白,用BCA试剂盒定量蛋白。蛋白样品加人5上样缓冲液在99下煮沸使之变性。随后进行 SDS-PAGE凝胶电泳、转印操作,转膜完毕用5%脱脂牛奶在室温下封闭1h,稀释一抗(兔抗Nrf2多克隆为1:50 0;兔抗PRDX1多克隆为1:800)并在4下孵育过夜,次日回收一抗并用TBST洗膜30 min,在37 孵育辣根过氧化氢酶标记的羊抗兔IgG二抗(稀释比例为1:10 0 0 0)2 h,TBST洗膜30 min,上机曝光并
24、拷贝图片。利用ImageJ软件中计算条带灰度值,目的蛋白的条带参照内参蛋白进行归一化处理,并分析出目的白的表达量。2.6?real time RT-PCR按照说明书提取总RNA和miRNA,测定RNA浓度和纯度,纯度参照A260/280比值在1.8 2.0 之间。用反转录试剂盒合成对应的cDNA,将反应体系各成分依次加入至0.1 mL的八连管中,扣紧上盖。在离心机上混匀,上机检测,待反应结束后拷贝CT值进行分析。对数据进行相对定量分析,遵循2-AC方法。2.7免疫组织荧光染色石蜡切片经过烤片、脱蜡和灭活操作后,置于枸缘酸钠溶液中高温加热进行抗原修复,PBS洗涤后进行透膜封闭操作。按照比例稀释N
25、rf2 和PRDX1,加人一抗(兔抗来源 Nrf2 为1:500;兔抗来源PRDX1为1:2 0 0)孵育4过夜;然后洗涤孵育DyLight标记的羊抗兔(H+L)二抗(稀释比例为1:30 0),用抗荧光淬灭封片剂避光封片,最后用荧光显微镜拍摄图像并保存,所有图像批量采用相同伽马值并用ImageJ软件分析平均荧光强度。2.8氧化应激指标检测采用WST-8法和TBA法检测超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SO D)活性和丙二醛(malondialdehyde,M D A)含量,按照试剂盒说明书提取组织样品并稀释,在9 6 孔板上,依次加人样品和其余试剂并混匀,用酶标仪测定OD
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