斑马鱼幼鱼尾鳍再生的不同阶段对微塑料毒性响应的差异.pdf
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1、生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 18 卷 第 5 期 2023 年 10 月Vol.18,No.5 Oct.2023 基金项目:国家自然科学基金面上项目(22176176)第一作者:钱宝留(1998),男,硕士研究生,研究方向为生态毒理学,E-mail: *通信作者(Corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20230515002钱宝留,孙烽铸,吕军生,等.斑马鱼幼鱼尾鳍再生的不同阶段对微塑料毒性响应的差异J.生态毒理学报,2023,18(5):94-102Qian B L,Sun
2、F Z,Lv J S,et al.Different response to toxicity of microplastics in zebrafish larvae at different stages of caudal fin regeneration J.AsianJournal of Ecotoxicology,2023,18(5):94-102(in Chinese)斑马鱼幼鱼尾鳍再生的不同阶段对微塑料毒性响应的差异钱宝留,孙烽铸,吕军生,吕林欢,孙立伟*浙江工业大学环境学院,杭州 310032收稿日期:2023-05-15 录用日期:2023-07-25摘要:微塑料污染已成为
3、全球性的环境问题。研究证实,水环境中的微塑料可被水生生物摄取,并在不同生物学水平上产生一系列的毒性效应。同时,对于野生生物而言,保持正常的组织修复与再生能力对于个体和种群均极为重要。然而,之前的研究已表明微塑料暴露可抑制斑马鱼幼鱼的尾鳍再生。但是,再生的不同阶段对于微塑料毒性响应是否存在差异则未见报道。本研究以聚苯乙烯微球为微塑料的代表,先通过比较斑马鱼幼鱼在尾鳍再生不同阶段(即断尾前、再生前期和再生后期)暴露于微塑料(3 mg L-1)后的尾鳍面积以及游泳行为的变化,从尾鳍结构和功能上确定再生不同阶段对微塑料毒性效应的响应差异;进一步地,通过研究免疫系统和再生信号通路关键基因的转录水平变化,
4、初步揭示其中的相关机制。研究发现,微塑料暴露能够导致再生尾鳍面积减少。相较于断尾前或再生后期暴露,再生前期暴露的抑制程度更为显著。对幼鱼游泳行为的影响而言,不同阶段间也有类似的趋势。同时,3 个阶段的暴露似乎能下调免疫系统相关基因的转录水平,且再生期 2 个阶段暴露的影响相较于断尾前暴露更为显著。而对于再生信号通路相关基因而言,其转录水平变化虽然较为复杂,但也呈现再生阶段暴露的影响更为显著的趋势。总之,本研究表明再生阶段暴露可能是微塑料抑制尾鳍再生的重要窗口期,微塑料颗粒和伤口微界面的相互作用在其影响尾鳍再生时具有重要的意义。关键词:微塑料;鱼类;组织修复与再生;基因转录文章编号:1673-5
5、897(2023)5-094-09 中图分类号:X171.5 文献标识码:ADifferent Response to Toxicity of Microplastics in Zebrafish Larvae at Dif-ferent Stages of Caudal Fin RegenerationQian Baoliu,Sun Fengzhu,Lv Junsheng,Lv Linhuan,Sun Liwei*College of Environment,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310032,ChinaReceived 15
6、May 2023 accepted 25 July 2023Abstract:Microplastic pollution has been considered as a global problem.It has been confirmed that the micro-plastics in the aquatic environment can be ingested by aquatic organisms,and consequently result in toxicologicaleffects at the various level of biological organ
7、ization.On the other hand,the ability to restore tissue morphologyand function of wildlife is critical for individuals and population.However,our previous study has demonstratedthat microplastics can inhibit the fin regeneration in zebrafish larvae,but whether the responses will differ or notwhen fo
8、llowing exposure at different stages of regeneration remains unclear.In this study,the polystyrene micro-第 5 期钱宝留等:斑马鱼幼鱼尾鳍再生的不同阶段对微塑料毒性响应的差异95 spheres were adopted as model particles of microplastics,and the zebrafish larvae following caudal fin amputationwere exposed to microplastics(3 mg L-1)at di
9、fferent stages of regeneration(i.e.,the pre amputation stage,the earlyor the late stage of regeneration post amputation).Firstly,the area of regenerating fin and the locomotor behaviorsof fish were measured,and the effects of microplastic exposure at different stages were compared morphologicallyor
10、functionally.Moreover,the transcript level of genes involved in the signaling networks regulating fin regenera-tion and the immune response were determined to reveal the underlying mechanisms.It was confirmed that micro-plastic exposure could inhibit the fin regeneration,and the effect was more sign
11、ificant when following exposure atthe early stage of regeneration.Similar pattern was observed when the locomotor behaviors of fish exposed at dif-ferent stages of regeneration were compared.It was seemed that exposure to microplastics down-regulated the tran-scription of genes related to immune sys
12、tem,and the effects were more significant for the exposure post amputa-tion.Regarding the genes involved in the signaling networks regulating fin regeneration,although the changingtrend of transcriptional response differed among genes,the impacts of exposure post amputation were seemed to bemore sub
13、stantial.In conclusion,this study demonstrated the regenerating stages post amputation were the importantwindow of microplastic exposure,and the interaction between the particles and the tissue around the amputatedplane was critical for the inhibitive effects of microplastics on fin regeneration.Key
14、words:microplastic;fish;tissue repair and regeneration;gene transcription 自 20 世纪初人工合成塑料问世以来,便因其成本低廉、可塑性强等优异特性被大量使用。近 60 年来,塑料的产量呈爆炸式增长,目前全球每年生产量已经超过 3.6 亿 t1。由于塑料耐降解、回收利用率低,导致其废弃物大量进入环境,并在其中累积、迁移和扩散1。环境中的塑料废弃物在物理、(光)化学以及生物作用下,可以进一步碎裂为更小的固体颗粒2-3。其中,粒径5 mm 的塑料碎片和颗粒被称为微塑料4。同时,也有部分微塑料是人们特意制造的,比如个人护理品中的
15、塑料微珠5。近年来,微塑料已被证实广泛存在于自然界中,并被认为是塑料废弃物的主要形态6。水环境是塑料污染的重要汇。据估计,全球的塑料废弃物中约有 11%进入水体环境7,因此,微塑料污染对于水生生态系统的潜在危害受到了广泛关注。大量的研究都已表明,微塑料可被水生生物摄取,并可通过食物链传递,在不同生物学水平上产生一系列的毒性效应6,8。野生生物在环境中不可避免会遭受组织损伤,而影响其在环境中的适应性,因此,正常的组织修复与再生能力对于生物个体和种群均是极为重要的9。另一方面,组织受损但未能及时修复的生物可能对环境污染物的毒性作用更为敏感。然而,目前针对微塑料水生生物毒性的研究基本局限于健康生物体
16、,从而极有可能低估其生态风险。相对于哺乳动物,鱼类等低等脊椎动物具有更强大的再生能力。其中,斑马鱼尾鳍再生模型由于其组织结构相对简单、易于手术操作以及再生过程迅速等诸多优点而被广泛应用于再生科学以及毒理学中10。研究表明,经切除后,尾鳍的再生过程,即所谓“割处再生(epimorphic regeneration)”,在斑马鱼成鱼中持续 2 周,而幼鱼则仅需 3 d 即可完成10-11。在尾鳍被切除后,斑马鱼将会激活各种炎症以及再生相关基因,以促进尾鳍再生的顺利进行。整个再生过程可细分为 4 个阶段,即伤口愈合、上皮化、芽基形成和外生长10,12。对于成鱼而言,在尾鳍切除后的 0 12 h,上皮
17、细胞快速向断尾处迁移,促使伤口闭合,这个过程称为伤口愈合阶段。12 24 h 则为上皮化阶段,此过程中间质细胞向伤口迁移,使伤口表皮化。之后的 24 48 h 则为芽基形成阶段,随着表皮细胞的积聚,以及各种细胞的去组织化,伤口处开始形成芽基,以便后续再生过程的进行。芽基大致分为近端、远端、两侧区域。有别于正常的生长发育,芽基只存在于组织再生之中。而 48 h 直至尾鳍修复完全称之为外生长阶段,该阶段主要是近端的芽基快速生长以促使尾鳍的再生10,12。笔者研究组之前的研究已证实微塑料可以影响鱼类组织修复与再生能力13。然而,斑马鱼的尾鳍再生是一个高度组织化的过程,而微塑料作为颗粒物的特性使其对于
18、不同再生阶段的暴露途径以及毒性效应存在差异,尤其是断尾创口愈合前后,颗粒物和创口微界面的相互作用可能在微塑料影响尾鳍再生时具有重要意义。通过对斑马鱼尾鳍不同的再生96 生态毒理学报第 18 卷阶段进行微塑料的暴露,对比不同阶段对微塑料的响应差异,可以明确微塑料干扰尾鳍再生的窗口期,从而进一步揭示微塑料影响组织修复与再生的内在作用机制。本研究以目前相关文献较多的聚苯乙烯微球为微塑料的代表,先通过比较斑马鱼幼鱼在尾鳍再生不同阶段暴露于微塑料的尾鳍再生面积以及游泳行为的变化,从结构和功能上确定不同阶段对微塑料毒性效应的响应差异;进一步通过研究关键基因的转录水平变化,初步揭示其中的相关机制。1 材料与
19、方法(Materials and methods)1.1 化学试剂聚苯乙烯微球(CAS:9003-53-6,标称直径为 50nm)购自上海阿拉丁试剂有限公司。超声混匀后微塑料用超纯水配制成实验所需浓度。1.2 实验动物本实验用斑马鱼为购置于中国斑马鱼资源中心的 AB 系野生型,约为 6 个月龄,健康状况良好。成鱼养殖用水为经曝气和活性炭过滤处理 24 h 以上的自来水。雌雄分开饲养,每天早晚按时喂食丰年虫和商品饲料。每周定时清理鱼缸以保证水质清洁。鱼房温度控制在(28.01.0),光暗周期为14 h光 10 h 暗。按照标准方法配鱼13,收集斑马鱼鱼卵。28 下约72 h 胚胎孵化,挑选发育正
20、常的幼鱼用于后续研究。1.3 斑马鱼幼鱼尾鳍切除以及微塑料的暴露实验设置 4 个处理组,包括 1 个曝气水对照组(记为 Cont.)以及3 个尾鳍再生不同阶段的微塑料暴露组,具体如图 1 所示。我们之前的研究表明 1 mg L-1的 50 nm 聚苯乙烯微球在断尾后持续暴露可以抑制斑马鱼幼鱼尾鳍再生13。考虑到本研究的实验设计,微塑料暴露浓度均设为 3 mg L-1。其中,3 个不同阶段暴露分别为断尾前暴露,即暴露阶段在 72108 hpf(hour post fertilization,即受精后小时数),记为 3 mgL-1-1;断尾后再生前期暴露(108 144hpf),记为 3 mg L
21、-1-2;以及再生后期暴露(144 180hpf),记为 3 mg L-1-3。在暴露阶段之外,其他时间幼鱼均在曝气水中培养。在 108 hpf,所有幼鱼均进行断尾手术。断尾时,用三卡因(tricaine,CAS:886-86-2,浓度为 0.016%)溶液浸泡并麻醉幼鱼,之后将幼鱼平铺于琼脂板上,借助体视显微镜,用刀片紧沿着幼鱼脊柱末端切除尾鳍13-14。断尾后的幼鱼在曝气水中复苏后,放回之前的处理组内。暴露实验在 6孔板中进行,每个孔 5 mL 暴露液,放置 20 条幼鱼。每个处理4 个平行。在180 hpf,暴露实验结束。1.4 斑马鱼幼鱼尾鳍再生面积及游泳行为测定在 180 hpf 暴
22、露实验结束后,每个平行中随机挑选 5 条幼鱼,在显微镜进行拍照,记录幼鱼尾鳍再生状况,并利用 ImageJ 软件对尾鳍的再生面积进行量化,并以对照组进行归一13。同样,在暴露实验结束后,每个平行中随机挑选9 条幼鱼并转移到 96 孔板中,每孔 1 条幼鱼,并将暴露液更换为 100 L 曝气水。通过 Zebralab 高通量行为分析仪(Viewpoint,法国)先后对斑马鱼幼鱼自由游泳行为和在光周期下的游泳行为进行测定13。具体程序为:在连续光照适应 20 min 后,进行20 min 持续光照下自由游泳行为测定,之后在40min 明暗光周期下(10 min 暗-10 min 明-10 min
23、暗-10 min 明)检测幼鱼对明暗转化刺激下的行为响应。图 1 斑马鱼幼鱼断尾和微塑料暴露实验示意图Fig.1 Schematic of caudal fin amputation and microplastic exposure for larval zebrafish第 5 期钱宝留等:斑马鱼幼鱼尾鳍再生的不同阶段对微塑料毒性响应的差异97 1.5 斑马鱼幼鱼免疫系统及再生信号通路相关基因的转录水平测定 幼鱼断尾和暴露均如前所述。在暴露实验结束后,将幼鱼取样(4 个平行,每个平行约 20 条鱼合并为一个样品),并整体匀浆,用 Trizol(Takara,日本)按照厂商的说明提取总 RN
24、A。测定总 RNA 的浓度和纯度,在确认符合要求后,通过反转录试剂盒(Re-verTra Ace qPCR RT kit,Toyobo,日本)将 RNA 合成为 cDNA 第一链。参考之前的研究13,选取了再生信号通路相关基因,同时考虑到免疫系统在组织修复与再生中的重要作用,也挑选了免疫系统若干基因,使用 SYBR Green 荧光定量 PCR 试剂盒(Toyo-bo,日本)对其转录水平进行测定。其中,再生信号通路相关基因包括 Wnt/-catenin 通路中的lef1、wnt10a和wnt5b,成骨蛋白 BMP 通路中的bmp2b和bmp4,成纤维细胞 生 长 因 子 FGF 通 路 中 的
25、?fgf20a和fgfr1a,胰 岛 素 样 生 长 因 子 IGF 中 的?igf2b,Notch 中的gata6和mfap4,视黄酸 RA 中的?raldh2和cyp26a1,音猬因子 Hh 中shha,Activin 通?路中的activinb,以及尾鳍中细胞增殖的标志基因?pcna;而免疫系统相关基因则包括促炎性细胞因子?tnf-和il-1,抗炎性细胞因子il-10,调控因子nf-b2,趋化因子cxcl18b和cxcr3.2,其他细胞因子il-12,以及中性粒细胞和巨噬细胞的特异性标志基?因mpx和mpeg1。PCR 反应条件为 95 变性 3?min,之后 40 个循环设置为 95
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