SN∕T 5371-2021 国境口岸血吸虫PCR和荧光PCR检测方法(出入境检验检疫).pdf
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1、以正式出版文本为准I C S1 1. 0 2 0C C SC6 2中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 3 7 12 0 2 1 国境口岸血吸虫P C R和荧光P C R检测方法D e t e c t i o n m e t h o d o f s c h i s t o s o m a b y P C R a n d r e a l - t i m e f l u o r e s c e n c e P C R a t f r o n t i e r p o r t s2 0 2 1 - 0 6 - 1 8发布2 0 2 2 - 0 1 - 0 1实施中华人民共和国海关总署发 布
2、以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准国境口岸血吸虫P C R和荧光P C R检测方法S N/T 5 3 7 12 0 2 1*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部: (0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2 - 7 5 3 1网址 w ww. c u s t o m s k b . c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张0. 7 5 字数2 2千字2 0 2 1年7月第一版 2 0 2 1年7月第一次印刷印数 15 0 0*书号: 1 5 5 1
3、7 56 6 1 定价1 2. 0 0元以正式出版文本为准前 言 本文件按照G B/T 1. 12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分: 标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位: 中华人民共和国成都海关、 中华人民共和国重庆海关、 中华人民共和国福州海关。 本文件主要起草人: 田绿波、 石莹、 骆星丹、 何纬、 黄恩炯、 樊学军、 辛文瀚、 王俊贤。S N/T5 3 7 12 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准国境口岸血吸虫P C R和荧光P C R检测方法1 范围 本文件规定了国境口岸日本血吸虫、 埃及血吸虫、 曼氏
4、血吸虫P C R和三重实时荧光P C R检测的对象、 检测方法、 生物安全及结果报告。 本文件适用于国境口岸日本血吸虫、 埃及血吸虫、 曼氏血吸虫的实验室检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中, 注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件; 不注日期的引用文件, 其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。 G B 1 9 4 8 9 实验室 生物安全通用要求 S N/T 1 1 9 3 基因检验实验室技术要求 WS/T 2 3 0 临床诊断中聚合酶链反应(P C R) 技术的应用3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3
5、. 1 血吸虫 s c h i s t o s o m a 属于扁形动物门吸虫纲裂体吸虫科, 也称裂体吸虫。寄生于人体的有日本血吸虫、 埃及血吸虫和曼氏血吸虫等, 可引起血吸虫病。其幼虫在中间宿主螺类体内发育, 尾蚴通过皮肤、 粘膜进入人体内, 可侵及肺、 胃肠道、 泌尿和中枢神经系统, 有些虫卵随血流进入各器官, 引起各种症状, 如肝肿大, 严重时造成宿主死亡。日本血吸虫主要见于中国大陆、 日本、 中国台湾、 东印度群岛和菲律宾; 埃及血吸虫主要分布于非洲、 南欧和中东; 曼氏血吸虫主要分布于非洲和南美洲北部。血吸虫感染后会出现皮疹、 发热、 腹痛、 腹泻、 乏力、 肝脏不适等症状, 严重危
6、害人类的健康。日本血吸虫、 曼氏血吸虫成虫主要寄生于人体肠系膜下静脉, 埃及血吸虫成虫主要寄生于膀胱静脉丛。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 D E P C: 焦碳酸乙二酯(d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e) P AG E: 聚丙烯酰胺凝胶电泳(p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s) F AM:6 -羧基荧光素(6 - c a r b o x y f l u o r e s c e i n) B HQ: 黑洞淬灭基团(b l a c k h o l e q
7、 u e n c h e r)5 检测对象5. 1 国境口岸发现的有皮疹、 发热、 腹痛、 腹泻、 乏力、 肝脏不适等症状, 疑似血吸虫感染病人。1S N/T5 3 7 12 0 2 1以正式出版文本为准5. 2 来自血吸虫感染疫区人员。5. 3 其他申请检验的人员。6 生物安全和P C R防污染要求 实验室生物安全和运输要求应符合G B 1 9 4 8 9的规定。P C R防污染措施按S N/T 1 1 9 3和WS/T 2 3 0的规定执行。7 主要试剂7. 1 无R NA酶的D E P C水。7. 2 D NA提取液( 含0. 9% N a C l和0. 1% E D T A - N a
8、2的混合液) 。7. 3 引物应用液浓度配制成2 0 m o l/L, 引物和探针见表1。等效商品化试剂也可使用。 表1 血吸虫P C R和实时荧光P C R检测引物及探针引物及探针名称序列(5- 3 )扩增片段日本血吸虫P C R检测引物S j - F 15- G G T TA T G G T T T G T T G A T G T TA G G - 3S j - R 15- A C T AA T T C A C T C T C G GA C T C A C C - 32 6 9 b p曼氏血吸虫P C R检测引物S m - F 15- A G T TA C T R G GAAAG G T
9、G AAA G T G C - 3S m - R 15- C A C T AAAA C A C T C C T TA T A C C R G G - 33 5 0 b p埃及血吸虫P C R检测引物S h - F 15- G C G GA T GA T T T T C G T T G T T A G G - 3S h - R 15- T T C AG A C T C G G AA TA G T C A C A T G G - 33 9 8 b p日本血吸虫实时荧光P C R检测引物S j - F5- G G G G T T T G T A T T A T AAG T T T A T G A T
10、 G T T - 3S j - R5- C A C A C G AA C A G C A C TAA T C AA T C - 3S j - P5- F AM - C C AA GAA C C T C AA C C T AA C A T C AA C AA -B HQ 1 - 31 2 5 b p曼氏血吸虫实时荧光P C R检测引物及探针S m - F5- A G TAA G T G AG AA T AA T C G T A C G C C - 3S m - R5- G G AA T AAA C A T C A T AG C A TA T T C A C A - 3S m - P5- HE X
11、 - A C A C C A C T C A C AA G C T C A C T C T - B HQ 1 - 31 3 5 b p埃及血吸虫实时荧光P C R检测引物S h - F5- G G C A T G G T T AA T AG T R T T A T T AA G AG AG - 3S h - R5- G G AA T A C T C G C AA G C AAA TA T AA C - 3S h - P5- R e d 6 1 0 - A G TAA T C G TA C A C C A T G T G A C T A T T C -B HQ 2 - 31 3 9 b p 注:
12、 引物序列中的简并碱基R表示G或A。7. 4 P C R基础试剂: 市售商品化试剂。7. 5 电泳缓冲液(1 0T B E) : 称取1 0 8 g T r i s碱,7. 4 4 g N a2E D T AH2O和5 5 g硼酸, 溶于8 0 0 m L的d d H2O中, 充分搅拌溶解后加水定容至1 L, 室温保存。7. 6 G o l d e n V i e w核酸染料( 或其他等效核酸染料) : 使用浓度为5 L/5 0 m L。2S N/T5 3 7 12 0 2 1以正式出版文本为准8 主要仪器 主要仪器设备如下: 二级生物安全柜; 台式高速冷冻离心机( 最高离心力1 2 0 0
13、0 g以上) ; 涡旋振荡器; 冰箱:4 和-2 0 ; 超净工作台; 微型离心机; P C R仪; 荧光定量P C R仪; 凝胶成像分析系统; 电子天平(d=1 m g) ; 微波炉; 电泳仪; 高压灭菌锅; 超纯水器或双蒸水器; 微量可调移液器一套( 含以下5种规格:1 0 L、2 0 L、1 0 0 L、2 0 0 L、1 m L) 。9 样品采集与运输9. 1 样品采集9. 1. 1 粪便标本 采集新鲜粪便于一次性无菌采便管内, 成形便采集5 g 8 g, 水样便采集1 m L3 m L。采便管外表贴上带有唯一识别号码的标签, 直接用于检测, 或保存, 或送检。9. 1. 2 尿液标本
14、 用无菌容器采集3 m L5 m L, 密闭后外表贴上带有唯一识别号码的标签, 直接用于检测, 或保存,或送检。9. 1. 3 血液 用无菌容器采集2 m L3 m L抗凝血( 非肝素) , 密闭后外表贴上带有唯一识别号码的标签, 直接用于检测, 或保存, 或送检。9. 2 样本的运送与保存 样本运输采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封运输。对于不立即检测的样本, 应保存于-2 0 及以下待检。3S N/T5 3 7 12 0 2 1以正式出版文本为准1 0 实验室检验1 0. 1 样品处理 取黄豆大小约1 0 0 m g 2 0 0 m g的粪便, 加入5 0 0 L的生理盐水, 振荡混匀, 制成2
15、 0 %4 0 %的混悬液; 或取2 m L血液, 静置待自然分层, 吸取上层血浆层及中层B u f f y c o a t层; 或取3 m L尿液。然后1 6 2 0 0 g离心2 m i n。弃去上清。不能立即进行检测时, 样本冻存于-2 0 冰箱备用。1 0. 2 核酸提取 在标本的前处理沉淀中, 加入1 0 0 L D NA提取液(7. 2) 充分混匀, 沸水浴1 0 m i n( 误差不超过1 m i n) 。1 6 2 0 0 g 离心5 m i n, 上清可直接用于P C R反应。也可以使用商品化的D NA提取试剂盒并按其说明书操作。1 0. 3 空白对照和阴、 阳性对照设置 检
16、测过程中分别设空白对照和阴、 阳性对照。阴性对照为不含血吸虫核酸的标本。阳性对照为日本、 埃及、 曼氏血吸虫阳性样本核酸, 或者为克隆的日本、 埃及、 曼氏血吸虫部分D NA序列( 必须包含扩增区域在内) , 序列见附录A。空白对照为d d H2O。1 0. 4 P C R检测1 0. 4. 1 反应体系组成1 0. 4. 1. 1 日本血吸虫反应体系为4 0 L, 组成如下: M a s t e r M i x( 含P C R缓冲液、d NT P、M g2+、T a p酶) 干粉球 D E P C水3 5 L S j - F 1 (2 0 m o l/L)0. 5 L S j - R 1(2
17、 0 m o l/L)0. 5 L 模板4 L1 0. 4. 1. 2 曼氏血吸虫反应体系为4 0 L, 组成如下: M a s t e r M i x( 含P C R缓冲液、d NT P、M g2+、T a p酶)干粉球 D E P C水3 5 L S m - F 1 (2 0 m o l/L)0. 5 L S m - R 1(2 0 m o l/L)0. 5 L 模板4 L1 0. 4. 1. 3 埃及血吸虫反应体系为4 0 L, 组成如下: M a s t e r M i x( 含P C R缓冲液、d NT P、M g2+、T a p酶)干粉球 D E P C水3 5 L S h - F
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