UPLC-MS_MS测定大黄蛰虫丸中的9种成分.pdf
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1、426 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期收稿日期:2022-07-08作者简介:刘丽,硕士研究生,研究方向:食品和药品检验检测,E-mail:UPLC-MS/MS测定大黄蛰虫丸中的9种成分刘 丽,王建成,韩庆霞,王 亮,王 娜(临沂市检验检测中心,山东 临沂 276001)摘 要:目的 建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定大黄蛰虫丸中黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵含量的分析方法。方法 采用Agilent Technologies Infinity Lab Poroshell 120 EC
2、-C18(4.6 mm100 mm,2.7 m)色谱柱,以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速0.3 ml/min;电喷雾离子源正负同时检测,多反应监测(MRM)扫描模式,通过比较供试品与对照品的色谱保留时间、色谱峰面积,同时进行黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵的定量测定。结果 9种成分线性范围的相关系数(r)均不低于0.998,回收率为93.77%101.27%,RSD为0.57%1.79%。结论 该法快速简便、高通量、选择性好、灵敏度高,能为大黄蛰虫丸的质量控制提供依据。关键词:超高效液相色谱-串联质谱;大黄蛰虫丸;定量分析中图
3、分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:1672-979X(2023)05-0426-06DOI:10.3969/j.issn.1672-979X.2023.05.009Simultaneous Determination of 9 Components in Dahuang Zhechong Pills by Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryLIU Li,WANG Jian-cheng,HAN Qing-xia,WANG Liang,Wang Na(Linyi Inspection and T
4、esting Center,Linyi 276001,China)Abstract:Objective To establish an ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)method for the simultaneous determination of baicalein,baicalin,amygdalin,chrysophanol,physcion,liquiritin,paeoniflorin,verbascoside and monoammonium glycyr
5、rhizinate in Dahuang Zhechong Pills.Methods An Agilent Technologies Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18 column(4.6 mm100 mm,2.7 m)was used with acetonitrile-0.1%formic acid aqueous solution as mobile phase for gradient elution.The flow rate was 300 ml/min.The electrospray ion source detection was perf
6、ormed at the same time under multiple reaction monitoring(MRM)scanning mode.The chromatographic retention time and chromatographic peak area of the samples and the reference were compared,and the contents of baicalein,baicalin,amygdalin,chrysophanol,physcion,liquiritin,paeoniflorin,verbascoside and
7、monoammonium glycyrrhizinate were determined.Results The correlation coefficients(r)were not less than 0.998,the recoveries were 93.77%-101.27%,and the RSDs were 0.57%-1.79%for the nine compositions.Conclusion The method is quick and simple,and has high flux,good selectivity and high sensitivity.It
8、can provide evidence for quality control of Dahuang Zhechong Pills.Key Words:UPLC-MS/MS;Dahuang Zhechong Pills;quantitative analysis食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期 427大黄蛰虫丸源于汉代医圣张仲景编著的金匮要略,收载于中国药典2020年版一部1,主要由熟大黄、干漆(煅)、桃仁、炒苦杏仁、黄芩、地黄、白芍、甘草、土鳖虫(炒)、水蛭(制)、虻虫(去翅足,炒)、蛴螬(炒)等十二味中药组成,同时含有植物药和动物药;具有活血破瘀、通经消癥
9、的功能,用于瘀血内停所致的癥瘕、闭经,症见腹部肿块、肌肤甲错、面色黯黑、潮热羸瘦、经闭不行1,可用于慢性肝炎、肝纤维化和肿瘤的辅助治疗等2-9。中国药典2020年版一部中对大黄蛰虫丸含量的测定仅包括大黄素和大黄酚1,缺乏对其他有效成分含量的控制。大黄蛰虫丸药效需要复方协同发挥作用,多成分全面质量控制具有重要意义,由于其他动物药目前缺乏明晰的有效成分指标,因此,本文参考中国药典中桃仁、苦杏仁、黄芩、白芍等质量控制指标,选取黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵等9种成分的含量对大黄蛰虫丸进行质量控制。目前,已报道的大黄蛰虫丸成分测定主要方法有高效液相色
10、谱法(HPLC)1,10-13,但多种成分同时测定的方法较少。HPLC在测定中需要对每个化合物的最大吸收波长进行扫描获取,同时在多组分测定中需要切换波长;与质谱检测器相比,紫外检测器灵敏度较低,对液相色谱分离技术也提出更高要求。采用超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS/MS),以液相色谱作为分离系统,质谱为检测系统,样品在质谱部分和流动相分离,被离子化后,经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开,经检测器得到质谱图;具有高灵敏度、对色谱分离要求相对简单、多成分同时测定、检测效率高等优点。为了保证测定的灵敏度,UPLC-MS/MS只需特定的离子对即可14。UPLC-MS/MS广泛用于生化
11、分析、药代动力学、食品安全、化妆品和保健食品分析和环境污染物分析等领域15-22。本文采用UPLC-MS/MS,通过多反应监测模式(MRM)和正负离子同时采集方式,在一个分析周期内完成对样品溶液中黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵等9种成分的扫描,得到准确质量数和准确碎片离子信息。1 仪器与试药1.1 仪器Exion LC AD/Triple Quad 4500超高效液相色谱-质谱联用仪(美国SCIEX公司),配备有ESI源,Exion LC AD超高效液相色谱仪配备高压二元泵(最大耐压100 MPa)、自动进样器(温控)、柱温箱(温控)、在线控
12、制器。Analyst Software 3.2软件,用于仪器控制、设置化合物参数、数据采集。SCIEX OS软件用于数据处理。KQ-300 GDV温控超声仪(昆山市超声仪器公司)。Mettler XP 205电子天平(梅特勒-托利多公司)。1.2 试药黄芩素对照品(批号:111595-201808,含量以97.9%计)、黄芩苷对照品(批号:110715-201821,含量以95.4%计)、苦杏仁苷对照品(批号:110820-201808,含量以88.2%计)、大黄酚对照品(批号:110796-201922,含量以99.4%计)、大黄素甲醚对照品(批号:110758-201817,含量以99.2
13、%计)、甘草苷对照品(批号:111610-201908,含量以95.0%计)、芍药苷对照品(批号:110736-202044,含量以96.8%计)、毛蕊花糖苷对照品(批号:111530-201914,含量以95.2%计)、甘草酸铵对照品(批号:110731-202021,含量以96.2%计),均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯(美国默克试剂公司);甲酸为色谱纯(上海阿拉丁);水为超纯水(Milipore超纯水机);其他试剂均为分析纯。5批不同厂家生产大黄蛰虫丸(市售)。2 方法与结果2.1 液相色谱-质谱联用条件2.1.1 色谱条件 色谱柱:Agilent Technologies I
14、nfinity Lab Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm100 mm,2.7 m);流动相:乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)进行梯度洗脱(02 min,70%B;212 min,10%B;1215 min,70%B);自动进样器温度:15;柱温:40;流速:0.3 ml/min;进样量:5 l。428 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期2.1.2 质谱条件 Triple Quad 4500质谱系统配有Turbo V ESI源,采用MRM和正负离子同时扫描模式,电子喷雾电压为+5500 V/-4500 V,离子源温度为500,气帘气使用氮气
15、,流速为25.0 psi,碰撞气使用氮气,流速为9.0 psi,喷雾气使用空气,流速为55.0 psi,辅助加热气为空气,流速为55.0 psi。使用SCIEX质谱专用校正液进行PPG质量准确度校准一次质量轴。使用Q1 Scan方式确定化合物母离子的质荷比,准确到小数点后一位,母离子扫描范围为50.01300.0 m/z,针泵恒流进样流速设为10.000 l/min,持续时间(Duration)设为5.00 min,正负模式分开扫描。使用Product Ion Scan(MS2)确定子离子的质荷比,准确到小数点后一位,Product Of设为母离子质荷比,定持续时间(Duration)为2.0
16、0 min,设定碰撞电压(CE)初始值为5 eV,可按需求以5 eV为步长手动调节,母离子的强度为图谱中基峰强度的1/3到1/4为宜,待仪器稳定后选择至少23个子离子。使用MRM优化化合物参数,驻留时间(Dwell Time)设为100 ms,用“Ramp”优化碰撞能量(Collision Energy)和去簇电压(Declustering Potential),连续优化2次,以得到较确切结果。黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵等9种化合物的保留时间、准确质量数、二级碎片离子信息、去簇电压、碰撞能量见表1。混合对照品溶液和供试品溶液总离子流图谱见
17、图1。2.2 溶液配制2.2.1 系列浓度混合对照品溶液 分别精密称取黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵对照品各约10 mg,置入50 ml量瓶,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为混合对照品贮备液(约0.2 mg/ml);再分别精密吸取上述贮备液适量,加甲醇溶液逐步稀释得到0.04,0.08,0.10,0.20,0.40,0.80,1.0 g/ml的系列浓度混合对照品溶液。2.2.2 供试品溶液 取供试品,研细后,精密称取细粉约3.0 g,置入50 ml量瓶,加甲醇约30 ml,超声30 min(功率160 W,频率40 kHz),放冷,加甲醇稀
18、释至刻度,摇匀,0.22 m微孔滤膜滤过。精密量取续滤液10 ml,置入100 ml量瓶,用10%甲醇-水溶液稀释至刻度,摇匀,即得。2.3 方法学考察2.3.1 专属性考察 取对照品、供试品溶液适量,按2.1项条件测定,结果见图1。由图1可见,各成分离子对和溶剂对测定无干扰,表明该方法专属性良好。2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取系列混合对照品溶液各5 l,注入液相色谱仪,记录峰面积;以待测成分质量浓度X为横坐标,峰面积Y为纵坐标绘表1 9种成分的保留时间和质谱参数分析物保留时间/min前体离子Q1(m/z)Q3(m/z)DP/V CE/V黄芩素8.44M-H-270.2243.0-10
19、4-32224.0-111-34黄芩苷6.89M-H-446.1270.0-95.0-38175.0-101-17苦杏仁苷4.37M-H-457.2324.1-106-18179.0-105-22大黄酚11.79M-H-254.1226.2-90-38119.0-88-38大黄素甲醚12.34M-H-284.2241.0-95-38269.0-75-27甘草苷4.94M-H-418.3256.0-100-27135.1-121-42芍药苷4.65M-H-480.3121.1-104-36328.0-105-20毛蕊花糖苷4.45M-H-624.3462.1-151-40161.1-151-42
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