Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型VP60蛋白重组腺病毒的构建及鉴定.pdf
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1、中国畜牧兽医 ,():C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y&V e t e r i n a r yM e d i c i n eK o z a k序列引导的表达兔出血症病毒型V P 蛋白重组腺病毒的构建及鉴定肖璐,于吉锋,罗燕,谢晶,叶勇刚,吴学婧,毛从剑,李兴玉,曹冶,林毅,潘梦,叶健强,魏勇,康润敏(四川省畜牧科学研究院,动物遗传育种四川省重点实验室,成都 ;四川农业大学,动物疫病与人类健康四川省重点实验室,成都 )摘要:【目的】试验旨在以复制缺陷型人型腺病毒(A d)为载体,构建K o z a k序列引导的表达兔出血症病毒型(RHD V)V P 蛋白
2、的重组腺病毒,为RHD V 新型疫苗研究提供依据.【方法】修饰、合成带有K o z a k序列的V P 基因序列,将其与腺病毒穿梭质粒进行重组,转化大肠杆菌T O P 感受态细胞,构建重组腺病毒穿梭质粒,并利用酶切与测序对重组腺病毒穿梭质粒进行鉴定;采用A dM a x腺病毒包装系统,基于HE K 细胞进行穿梭质粒与 腺 病 毒 骨 架 质 粒 的 定 点 同 源 重 组,构 建 重 组 腺 病 毒A d RHD V V P 并 感 染HE K 细 胞,通 过R T P C R、W e s t e r nb l o t t i n g及间接免疫荧光试验(I F A)对重组腺病毒进行表达验证;利
3、用R e e d M u e n c h方法测定重组腺病毒的病毒滴度.【结果】重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定结果可见条大小分别为 和 b p的条带,测序比对结果显示,其与G e n B a n k中公布的相应序列相似性,表明穿梭质粒构建成功.R T P C R结果可见大小约为 b p的特异性条带;W e s t e r nb l o t t i n g结果显示,大小约为 k u的V P 蛋白特异性条带;I F A观察结果显示,感染重组腺病毒的HE K 细胞产生了绿色荧光,表明重组病毒能在HE K 细胞中表达V P 蛋白,且该蛋白具有良好的抗原性;病毒滴度测定结果显示,初代重组腺病毒的T C I D
4、 为 /m L.【结论】本试验构建了含RHD V V P 基因的重组腺病毒,并成功表达了RHD V V P 蛋白,为进一步研究开发RHD V 疫苗提供了病毒模型.关键词:兔瘟;兔出血症病毒型(RHD V);重组腺病毒;HE K 细胞;K o z a k序列中图分类号:S 文献标识码:AD o i:/j c n k i 开放科学(资源服务)标识码(O S I D):收稿日期:基金项目:四川省省级科研院所基本科研业务费项目(S A S A 、S A S A );四川省自然科学基金项目(N S F S C );四川省区域创新合作项目(Y F Q );四川省财政运行专项(S A S A C Z Y X
5、 )联系方式:肖璐,E m a i l:y a a n x i a o l u c o m;于吉锋,E m a i l:q q c o m.肖璐和于吉锋对本文具有同等贡献,并列为第一作者.通信作者康润敏,E m a i l:q q c o mC o n s t r u c t i o na n dI d e n t i f i c a t i o no faR e c o m b i n a n tA d e n o v i r u sE x p r e s s i n gR a b b i tH e m o r r h a g i cD i s e a s eV i r u sT y p e
6、(R H D V)V P P r o t e i nL e a d e db yK o z a kS e q u e n c eX I AOL u,YUJ i f e n g,L UOY a n,X I EJ i n g,Y EY o n g g a n g,WUX u e j i n g,MAOC o n g j i a n,L IX i n g y u,C AOY e,L I NY i,P AN M e n g,Y EJ i a n q i a n g,WE IY o n g,KANGR u n m i n(S i c h u a nP r o v i n c i a lK e yL a
7、b o r a t o r yo fA n i m a lB r e e d i n ga n dG e n e t i c s,S i c h u a nA n i m a lS c i e n c eA c a d e m y,C h e n g d u ,C h i n a;K e yL a b o r a t o r yo fA n i m a lD i s e a s ea n dH u m a nH e a l t ho fS i c h u a nP r o v i n c e,S i c h u a nA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i
8、 t y,C h e n g d u ,C h i n a)期肖璐等:K o z a k序列引导的表达兔出血症病毒型V P 蛋白重组腺病毒的构建及鉴定A b s t r a c t:【O b j e c t i v e】T h ep u r p o s eo ft h i ss t u d y w a st oc o n s t r u c tar e c o m b i n a n tA d e n o v i r u se x p r e s s i n gR a b b i tg e m o r r h a g i cd i s e a s ev i r u st y p e(RHD V
9、)V P p r o t e i nl e a d e db y K o z a ks e q u e n c e,b a s e do nar e p l i c a t i o n d e f e c t i v eH u m a na d e n o v i r u s t y p e(A d)a n dp r o v i d eab a s i s f o rt h er e s e a r c ho fRHD V n e w v a c c i n e【M e t h o d】T h eV P g e n e w i t h K o z a ks e q u e n c e w e
10、r em o d i f i e d,s y n t h e s i z e da n dc l o n e dt or e c o m b i n a n tA d e n o v i r u ss h u t t l ep l a s m i d,a n dt r a n s f e r r e d i n t oE s c h e r i c h i ac o l iT O P c o m p e t e n tc e l l st o c o n s t r u c t A d e n o v i r u s s h u t t l e v e c t o r,a n d t h er
11、 e c o m b i n a n t sw e r e a n a l y z e da n d i d e n t i f i e db yr e s t r i c t i o ne n z y m e a n ds e q u e n c i n g T h e r e c o m b i n a n tA d e n o v i r u sA d RHD V V P w a sp a c k a g e db yt h es i t e d i r e c t e dh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o no fs h u t t l
12、 ep l a s m i da n dA d e n o v i r u sb a c k b o n ep l a s m i d,b a s e do n HE K c e l l su s i n gt h eA d M a xs y s t e m T h e n,t h ee x p r e s s i o n w a sv e r i f i e d b yi n f e c t i n g HE K c e l l s,a n dt h er e c o m b i n a n tA d e n o v i r u sw a s i d e n t i f i e db yR
13、T P C R,W e s t e r nb l o t t i n ga n di n d i r e c t i mm u n o f l u o r e s c e n c ea s s a y(I F A),a n dt h et i t e ro ft h er e c o m b i n a n tA d e n o v i r u sw a sd e t e r m i n e db yR e e d M u e n c hm e t h o d【R e s u l t】S h u t t l ep l a s m i dd i g e s t i o nr e s u l t
14、s h o w e d t w ob a n d sw i t hs i z e so f a n d b p,a n dt h es e q u e n c i n g a l i g n m e n tr e s u l t ss h o w e dt h a ti ts h a r e d m o r et h a n s i m i l a r i t yt ot h ec o r r e s p o n d i n gs e q u e n c e sp u b l i s h e do nG e n B a n k,a n dt h er e s u l ts h o w e dt
15、 h a tt h es h u t t l ep l a s m i dw a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d T h er e s u l to fR T P C Rs h o w e dt h e b ps p e c i f i cb a n d,a n dt h eW e s t e r nb l o t t i n gr e s u l ts h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n t A d e n o v i r u se x p r e s s e da k u V P p
16、r o t e i n I F A r e s u l t ss h o w e dt h a t HE K c e l l si n f e c t e d w i t ht h er e c o m b i n a n t A d e n o v i r u sp r o d u c e dg r e e nf l u o r e s c e n c e,a n dt h eV P s p e c i f i cp r o t e i nc o u l de x p r e s si nt h eHE K c e l l s T h er e s u l t so fv i r u st
17、i t e rd e t e r m i n a t i o ns h o w e dt h a tt h eT C I D o ft h ep r i m a r yr e c o m b i n a n tA d e n o v i r u sw a s /m L【C o n c l u s i o n】T h i ss t u d yc o n s t r u c t e dar e c o m b i n a n tA d e n o v i r u sc o n t a i n i n gRHD V V P g e n e,w h i c hc o u l ds u c c e s
18、s f u l l ye x p r e s s RHD V V P w i t h g o o da n t i g e n i c i t y,a n dt h i ss t u d ya l s op r o v i d e dav i r u sm o d e l f o rf u r t h e rr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to fRHD V v a c c i n e K e yw o r d s:r a b b i th e m o r r h a g i cd i s e a s e;R a b b i th e m o r
19、 r h a g i cd i s e a s ev i r u st y p e(RHD V);r e c o m b i n a n tA d e n o v i r u s;HE K c e l l s;K o z a ks e q u e n c e 兔 出 血 症 病 毒型(R a b b i th e m o r r h a g i cd i s e a s ev i r u s t y p e,RHD V)是一种新型、外来兔瘟病毒,年,RHD V 于法国首次被发现,中国于 年在四川省成都市金堂县首次发鉴定并报道RHD V.与 经 典 兔 出 血 症 病 毒(R a b b i t
20、h e m o r r h a g i cd i s e a s ev i r u s,RHD V)相 比,RHD V 的感染宿主范围更广 ,死亡率在 之间 .RHD V 基因组大小约为 k b,V P 是该病毒中一种重要的结构蛋白,也是主要的保护性蛋白,同时与诱导抗病毒感染的免疫反应直接相关,且V P 基因具有高度保守的序列,因此,V P 可作为RHD V 疫苗研发的首选基因,具有较大的开发价值和研究潜力 .K o z a k序 列 最 早 由 美 国 女 科 学 家K o z a kM a r i l y n于 年提出,该序列是真核生物信使R NA(mR NA)起 始 密 码 子AUG两
21、侧 的 序 列,K o z a k序列可与其同核糖体小亚基的翻译起始因子结合,能辅助启动相关基因的表达,影响mR NA翻译,从而影响蛋白表达效率 .该序列是很多哺乳动物细胞中能提高基因表达的一个上游调控元件.研究表明,K o z a k序列用于真核基因表达载体的构建和表达,可提高细胞表达蛋白的水平且不影响目的蛋白的性质和功能,同时K o z a k序列对增强重组质粒诱导的体液免疫方面及攻毒保护力方面都会产生影响 .RHD V 感染后潜伏期短、传播快、发病急,对中国养兔业的健康发展造成了巨大威胁,目前,缺乏针对 该 病 的 有 效 防 控 措 施 和 商 业 化 疫 苗,现 有RHD V疫苗与R
22、HD V 几乎无交叉保护作用,而RHD V 组织灭活疫苗存在样品获取困难、制备时间长、成本高、产能有限等突出问题,且存在严重的病毒传播风险和生物安全隐患,因此,基因工程疫苗的研发是当下RHD V 防控的研究焦点.腺病毒载体以安全系数高、免疫原性强、宿主范围广、具有多中国畜牧兽医 卷组织亲嗜性、免疫接种途径多样、具有口服疫苗发展前景、表达外源基因能力强及可长时间稳定表达的特点,成为了一种理想的基因治疗及疫苗开发载体 .本研究拟基于复制缺陷型人型腺病毒(r e p l i c a t i o n d e f e c t i v e h u m a n a d e n o v i r u st y
23、p e,A d),在RHD V V P 基因的 端加入K o z a k序列,构建编码RHD V V P 蛋白的重组表达载体,并进行RHD V 重组腺病毒的包装与表达,为探索RHD V 新型疫苗奠定基础.材料与方法 材料HE K 细胞、A d、A dM a x系统p D C 腺病毒穿梭质粒和RHD V 多克隆抗体兔血清均由四川省畜牧科学研究院兽医研究所保存;T a qP C R预混试剂、G e n e R e d核酸染料、快速质粒小提试剂盒和琼脂糖均购自天根生化科技(北京)有限公司;L A固体培养基、氨苄西林均购 自O X O I D公司;D NA M a r k e r(b p)、D L D
24、 NAM a r k e r均购自北京百奥莱博科技有限公司;E c oR 和H i nd 限制性内切酶、蛋白质分子质量标准(k u)、大肠杆菌T O P 和DH 感受态细胞均购自T a K a R a公司;DMEM细胞培养基、胎牛血清均购自G i b c o公司;细胞培养瓶购自C o r n i n g公司;P o l y p l u s j e t P R I ME转染试剂、质粒稀释液均购自P o l y p l u s公司;D NA/R NA提取试剂盒购自济凡生物科技(北京)有限公司;M S u p e rP l u sq P C RR TK i tw i t hg D NAR e m o
25、 v e r购自北京聚合美生物科技有限公司;辣根过氧化物酶(HR P)标记的羊抗兔I g G、异硫氰酸荧光素(F I T C)标记的羊抗兔I g G均购自北京索莱宝科技有限公司;P u r e L i n kTME x p i无内 毒 素 大 量 质 粒 纯 化 试 剂 盒、R I P A裂 解 液、T B S T缓 冲 液、P B S、,二 脒 基 苯 基 吲 哚(D A P I)均购自T h e r m o F i s h e rS c i e n t i f i c公司.方法 靶序列合成与引物设计根据RHD V CHN/S C 毒株全基因组序列(G e n B a n k登录号:MT )
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