CRISPR_Cas12b核酸检测试剂的冻干配方筛选与优化.pdf
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1、 第3 2卷第3期2 0 2 3年9月江苏海洋大学学报(自然科学版)J o u r n a l o f J i a n g s u O c e a n U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n)V o l.3 2 N o.3S e p.2 0 2 3 D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.2 0 9 6-8 2 4 8.2 0 2 3.0 3.0 0 7C R I S P R/C a s 1 2 b核酸检测试剂的冻干配方筛选与优化*张胜胜1,吴 芳1,罗志丹1,王天琪1,黄庆媛1,卢 辰2(1.
2、江苏海洋大学 江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室,江苏 连云港 2 2 2 0 0 5;2.江苏省海洋资源开发研究院,江苏 连云港 2 2 2 0 0 5)摘 要:为解决现有C R I S P R/C a s 1 2 b核酸检测试剂需要冷链储运的问题,选取海藻糖、乳糖、蔗糖、普鲁兰多糖、酪蛋白、麦芽糊精、松三糖和甘露醇等8种常用的冻干保护剂,以真空冷冻干燥后相对酶活和物理状态为指标,通过对不同浓度保护剂的单因素试验和正交试验,筛选与优化冻干配方。结果表明,海藻糖、普鲁兰多糖和甘露醇具有较好的冻干保护性,且冻干产物物理性状较好,便于使用。最终确定的冻干配方为海藻糖0.1 4 g/m L,普鲁兰
3、多糖0.0 6 g/m L,甘露醇0.0 6 g/m L。使用该配方制备的C R I S P R/C a s 1 2 b冻干试剂,初始相对酶活为9 3.3 3%,在2 5 保存6 0 d或3 7 保存3 0 d后的相对酶活分别为8 1.0 4%和8 1.2 8%,具有良好的常温保存性,可用于进一步制备快速核酸检测试剂。关键词:C R I S P R/C a s 1 2 b;核酸检测;真空冷冻干燥中图分类号:Q 8 1 4.4 文献标志码:A 文章编号:2 0 9 6-8 2 4 8(2 0 2 3)0 3-0 0 4 3-0 6S c r e e n i n g a n d O p t i m
4、 i z a t i o n o f L y o p h i l i z e d F o r m u l a t i o n s o f C R I S P R/C a s 1 2 b N u c l e i c A c i d D e t e c t i o n R e a g e n t sZ HANG S h e n g s h e n g1,WU F a n g1,L UO Z h i d a n1,WANG T i a n q i1,HUANG Q i n g y u a n1,L U C h e n2(1.J i a n g s u K e y L a b o r a t o r
5、y o f M a r i n e P h a r m a c e u t i c a l C o m p o u n d S c r e e n i n g,J i a n g s u O c e a n U n i v e r s i t y,L i a n y u n g a n g 2 2 2 0 0 5,C h i n a;2.J i a n g s u I n s t i t u t e o f M a r i n e R e s o u r c e s D e v e l o p m e n t,L i a n y u n g a n g 2 2 2 0 0 5,C h i n
6、a)A b s t r a c t:I n o r d e r t o s o l v e t h e p r o b l e m o f c o l d c h a i n s t o r a g e a n d t r a n s p o r t a t i o n o f e x i s t i n g C R I S P R/C a s 1 2 b n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n r e a g e n t s,e i g h t c o mm o n l y u s e d c r y o p r o t e c t a n t s,i
7、 n c l u d i n g t r e h a l o s e,l a c t o s e,s u c r o s e,p u l l u l a n,c a s e i n,m a l t o d e x t r i n,r a f f i n o s e,a n d m a n n i t o l,w e r e s e-l e c t e d.T h e c r y o p r o t e c t a n t s w e r e t h e n s c r e e n e d a n d o p t i m i z e d b y e v a l u a t i n g t h e
8、 r e l a t i v e e n z y m e a c t i v i t y a n d p h y s i c a l s t a t e a f t e r l y o p h i l i z i n g,u s i n g d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f c r y o p r o t e c t a n t s w i t h s i n g l e-f a c t o r e x p e r i m e n t s a n d o r t h o g o n a l e x p e r i m e n t
9、 s.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t r e h a l o s e,p u l l u l a n,a n d m a n n i t o l h a d g o o d l y o p h i l i z i n g p r o t e c t i o n s,a n d t h e p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f t h e l y-o p h i l i z e d p r o d u c t s w e r e g o o d a n d e a s y t o u s e.T h e
10、 o p t i m i z e d l y o p h i l i z e d f o r m u l a t i o n w a s 0.1 4 g/m L o f t r e h a l o s e,0.0 6 g/m L o f p u l l u l a n,a n d 0.0 6 g/m L o f m a n n i t o l.T h e C R I S P R/C a s 1 2 b l y-o p h i l i z e d r e a g e n t p r e p a r e d w i t h t h i s f o r m u l a h a d a n i n i
11、 t i a l r e l a t i v e e n z y m e a c t i v i t y o f 9 3.3 3%.A f t e r b e i n g s t o r e d a t 2 5 f o r 6 0 d a y s o r a t 3 7 f o r 3 0 d a y s,t h e r e l a t i v e e n z y m e a c t i v i t i e s w e r e 8 1.0 4%a n d 8 1.2 8%,r e s p e c t i v e l y.I t h a d g o o d r o o m t e m p e r
12、 a t u r e s t a b i l i t y a n d c o u l d b e u s e d f o r f u r t h e r p r e p a r a t i o n o f r a p i d n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n k i t s.K e y w o r d s:C R I S P R/C a s 1 2 b;n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n;l y o p h i l i z a t i o n*收稿日期:2 0 2 3-0 3-0 4;修订日期:2 0 2
13、 3-0 3-2 7基金项目:江苏省研究生科研与实践创新计划项目(KY C X 2 0 2 1-0 3 8)作者简介:张胜胜(1 9 9 6),男,河南信阳人,硕士研究生,研究方向为分子诊断技术,(E-m a i l)z s s 9 2 6 1 1 2 31 6 3.c o m。通信作者:卢辰(1 9 8 2),男,湖北武汉人,副教授,博士,研究方向为生物信息学,(E-m a i l)l u c h e n j o u.e d u.c n。0 引言近年来,基于C R I S P R/C a s的核酸检测技术已被广泛应用于生物科学研究领域1。C R I S P R/C a s系统2是 由 成 簇
14、、规 律 间 隔 的 短 回 文 重 复 序 列(c l u s t e r e d r e g u l a r l y i n t e r s p a c e d s h o r t p a l i n d r o m i c r e p e a t s,C R I S P R)和C R I S P R相关蛋白(C R I S P R-a s s o c i a t e d p r o t e i n,C a s)组成,广泛存在于多数细菌中的一种适应性免疫系统。当外部的核酸分子侵入时,如果其中包含与c r R NA(C R I S P R R NA)反向互补的序列,就会被C R I S P
15、R/C a s系统识别并结合,触发C a s蛋白的顺式切割活性,使得侵入的核酸分子被 降 解。C a s 1 2 b(C 2 c 1)属 于C R I S P R系 统 中C l a s s 2 T y p e V家族内的一种蛋白,在它被特异性目标D NA分子激活顺式切割活性的同时,还会产生反式切割活性,即非特异性切割单链D NA。如果在单链D NA上标记荧光基团或生物素等,就可以产生放大后的信号。利用这个特性,研究人员基于C a s 1 2 b和多种核酸扩增技术开发了多种快速核酸检测技术,用于区分S N P、检测环状R NA、人类细胞mR NA、病原微生物核酸等,可以提高检测特异性和灵敏度3
16、-6。虽然C R I S P R/C a s 1 2 b核 酸 检 测 方 法 具 有 高效、灵敏和应用广泛等特点7,应用前景良好,但是,检测体系中的组分,如C a s 1 2 b蛋白、单链核酸探针、s g R NA等均为活性物质,需要冷链运输和低温储存,实验过程中的反复冻融操作也对其活性产生影响。所以亟待建立一种C R I S P R/C a s 1 2 b核酸检测体系的常温保存方法,以消除相关检测试剂对冷链的依赖,便于现场检测技术的推广应用。真空冷冻干燥技术是目前较为常用的试剂常温保存技术8,其基本策略是先将含水样品冻结到冰点以下,然后在真空状态下使水分直接由固态升华成气态而逸出,从而得到
17、干燥制剂。真空冷冻干燥技术能够有效保持生物制品的活性,并且产品疏松而多孔,容易复溶,已经被广泛应用于医药、食品工业等领域。但是冻干过程仍然有可能对生物制品带来物理或化学伤害,因此一般需要向原始溶液中加入一定比例的保护剂,以减少冻干对活性物质的伤害,改善冻干产品的溶解性和稳定性。由于生物制品种类繁多,各种制品的性质差异较大,目前并无通用的冻干保护剂供使用,对特定生物制品都需要进行保护剂配方的筛选和优化。目前,已 有研 究 人 员 制 备 了C R I S P R/C a s 1 2 a核酸检测体系的真空冻干试剂9,但尚未发现有针对C a s 1 2 b真空冻干研究的相关报道。本文首先选取了8种
18、常 用 的 冻 干 添 加 剂1 0-1 1,测 试 它 们 对C R I S P R/C a s 1 2 b检测体系预混液的保护效果,根据冻干试剂的物理状态和相对活性,筛选出候选冻干保护剂,然后利用正交试验方法1 2-1 3,得到冻干保护剂配方的优化方案,并测试了优化配方的保存稳定性,期望为进一步开发常温核酸检测试剂提供有效的技术方案。1 材料与方法1.1 材料与设备新冠病毒N基因D NA片段、s g R NA(5 -GU CUAGAG GA C AGAAUUUUU C AA C G G GUGUG CC AAUG G C C A C UUU C C AG GUG G C AAAG C C
19、C GUUGAG C UU C U C AAAU C UGAGAAGUG G C A CC GAAGAA C G C UGAAG C G C UG-3,下 划 线 表 示s p a c e r序 列)、单 链D N A探 针(5 -F AM-T T A T T-B HQ 1-3),购 自 通 用 生 物(安 徽)股 份 有 限 公 司;C a s 1 2 b购自江苏百时美生物科技有限公司;海藻糖、乳糖、蔗糖、普鲁兰多糖、酪蛋白、麦芽糊精、松三糖和甘露醇,购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。真空冷冻干燥机,上海豫明仪器有限公司;电子天平,上海光正医疗有限公司;恒温培养箱,上海博讯实业医疗设备有限
20、公司;单人垂直净化工作台,上海苏净实业有限公司;实时荧光定量P C R仪,美国B i o-R a d公司;光学显微镜(D N-1 0),北京普瑞赛司仪器有限公司。1.2 实验方法1.2.1 冻干试剂的制备 配制一定浓度的冻干保护剂和C R I S P R/C a s 1 2 b核酸检测预混液(0.0 6 g C a s 1 2 b,1 0 n g s g R NA,2 L 1 0 C a s 1 2 b R e a c t i o n B u f f e r,0.1 p m o l单链荧光探针,加去离子水补足体积到2 0 L),混合均匀。具体冻干操作流程如下:将样品置于冷阱或低温冰箱,使物品完
21、全冰冻结实;真空冷冻干燥机预冷不少于3 0 m i n;冷冻干燥机内样品干燥6 h;取样,盖上离心管盖并用封口膜密封。1.2.2 冻干试剂的活性测定 真空冷冻干燥后取出样品,加入1 9 L水和1 L新 冠病 毒N基因D NA片段(1 0 n g/L),共2 0 L于0.2 m L P C R管中复融,涡旋震荡混合均匀。同时设置未冻干的44江苏海洋大学学报(自然科学版)2 0 2 3年9月C R I S P R/C a s 1 2 b核酸检测预混液为阳性对照。每组设3个复孔,放入实时荧光定量P C R仪中反应。设置的反应程序为:6 0,4 5 m i n,每分钟读荧光值一次。冻干样品复融后计算相
22、对酶活,其公式为:相对酶活(%)=冻干试剂的荧光值/阳性对照荧光值1 0 0%。1.2.3 冻干保护剂的初步筛选 选取海藻糖、乳糖、蔗糖、普鲁兰多糖、酪蛋白、麦芽糊精、松三糖和甘露醇等8种常用的冻干保护剂,按照“1.2.1”的方法,分别按终质量浓度0.0 5 g/m L和0.1 0 g/m L制备C R I S P R/C a s 1 2 b冻干试剂,肉眼观察冻干产物性状。同时设立以去离子水代替保护剂的阴性对照。再按照“1.2.2”的方法测定冻干试剂的相对酶活,筛选出候选保护剂。1.2.4 单因素试验 针对初步筛选出的候选冻干保护剂,设置一系列 终浓度梯度,按单因素制 备C R I S P R
23、/C a s 1 2 b冻干试剂并测定活性。根据实验结果确定后续正交试验采取的因素水平。1.2.5 正交试验 根据单因素试验得到的冻干保护剂种类和浓度因素水平进行正交试验,制备不同配方的冻干试剂。在显微镜下观察冻干产物性状,同时测定相对酶活(试验结果重复3次,取平均值)。采用S P S S 1 9.0 统计软件对正交试验结果进行极差分析和方差分析,得到冻干保护剂的添加剂保护作用强弱的主次因素和优化组合方案。1.2.6 冻干试剂稳定性考察 按照已有文献报道的冻干试剂储存稳定性考察方法1 4,将C R I S P R/C a s 1 2 b核酸检测体系优化方案的冻干试剂分别置于2 5 和3 7 保
24、存,定期取出检测相对酶活,验证正交试验得到的保护剂组合是否可靠。2 结果2.1 冻干保护剂初步筛选由图1不同保护剂对预混液的保护作用可以看出,添加乳糖组和松三糖组冷冻干燥后酶活低于对照组,其余6组对预混合液在冻干过程中均具有一定的保护效果。海藻糖、普鲁兰多糖和甘露醇不仅能在真空冷冻干燥过程中保留明显高于阴性对照组的酶活,而且得到的冻干产品均匀饱满分布,在离心管中没有凹陷和坍塌,取出较为方便,轻轻揉捏便可成为粉末,可以认为具有良好的品质特征。酪蛋白、蔗糖和麦芽糖糊精在冻干过程中对预混液保护作用明显,但是冻干得到的物质与试管壁粘合,流动性差。因此初步选定海藻糖、普鲁兰多糖和甘露醇为候选保护剂进行单
25、因素试验。图1 不同保护剂对C R I S P R/C a s 1 2 b预混液的保护作用F i g.1 P r o t e c t i v e e f f e c t o f d i f f e r e n t c r y o p r o t e c t a n t s o n p r e m i x e s C R I S P R/C a s 1 2 b2.2 单因素试验分别设置更多的海藻糖、普鲁兰多糖和甘露醇终质量浓度梯度制备冻干试剂,检验它们单独作为冻干保护剂的效果,结果见图2。海藻糖对于保护C R I S P R/C a s 1 2 b核酸检测预混液具有较好的效果,冻干后相对酶活可达
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- CRISPR_Cas12b 核酸 检测 试剂 配方 筛选 优化
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