miR-196b靶向ERG促进肺腺癌的增殖和迁移.pdf
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1、刘邦卿,唐山市人民医院胸外二科主治医师,医学硕士,中国抗癌协会会员,河北省急救医学会肿瘤专业委员会委员,唐山市抗癌协会胸部肿瘤专业委员会委员,唐山市抗癌协会第 2 届肿瘤免疫治疗专业委员会委员,唐山市医学会胸心血管外科学会委员。擅长领域:肺结节、肺癌、纵隔肿瘤、肺部良性肿瘤等胸部微创手术;食管癌、肺癌、纵隔恶性肿瘤的综合治疗。研究方向:胸部肿瘤的基础与临床,肺癌、食管癌等胸部肿瘤的遗传学和表观遗传学研究,参与国家自然科学基金及省级自然科学基金各 1 项,市级科研课题项目 1 项。以第一作者身份发表 SCI 论文 2 篇,中文核心期刊论文 2 篇。miR-196b 靶向 ERG 促进肺腺癌的增殖
2、和迁移刘邦卿1),李剑锋1),刘晓辉1),张劲男2),梁金屏2)(1)唐山市人民医院胸外二科;2)头颈外科,河北 唐山063000)摘要 目的探究 miR-196b 影响肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)进展的机制。方法通过 TCGA 数据库分析 miR-196b 在 LUAD 组织中的表达水平,利用 TargetScan 预测其下游靶基因并用双荧光素酶实验进行验证,qRT-PCR 检测 miR-196b 和 ETS 相关基因(ETS-related gene,ERG)在 LUAD 细胞系中的表达情况,MTT、划痕愈合和 Transwell 实验分别检测不同处理后 LU
3、AD 细胞的增殖、迁移和侵袭能力的变化情况。结果miR-196b 在 LUAD 中高表达(P=3.50e-17)并靶向负调控 ERG,过表达 miR-196b 能够促进 LUAD 细胞的增殖、迁移和侵袭(P 0.05),回复实验证实 miR-196b/ERG 调控轴能够影响 LUAD 细胞增殖、迁移和侵袭(P 0.05)。结论miR-196b 靶向 ERG 促进 LUAD 进展的分子机制,对开发 LUAD 新的临床治疗方法具有潜在意义。关键词miR-196b;ERG;肺腺癌;增殖;迁移中图分类号 R734.2 文献标志码 A 文章编号 2095 610X(2023)10 0083 09MiR-
4、196b Promotes Proliferation and Migration of LungAdenocarcinoma by Targeting ERGLIU Bangqing1),LI Jianfeng1),LIU Xiaohui1),ZHANG Jinnan2),LIANG Jinping2)(1)The 2nd Dept.of Thoracic Surgery;2)Dept.of Head and Neck Surgery,Tangshan PeoplesHospital,Tangshan Hebei 063000,China)Abstract ObjectiveTo explo
5、re the mechanisms of miR-196b affecting the progression of lungadenocarcinoma(LUAD).MethodsThe expression level of miR-196b in LUAD tissues was analyzed throughTCGA database.TargetScan was used to predict its downstream target genes,and dual-luciferase assay wasperformed to validate the predictions.
6、qRT-PCR was used to detect the expression of miR-196b and ETS-relatedgene(ERG)in LUAD cell lines.MTT,scratch healing,and Transwell assays were used to respectively assess thechanges in proliferation,migration,and invasion abilities of LUAD cells after different treatments.ResultsmiR-196b was highly
7、expressed in LUAD(P=3.50e-17)and negatively regulated ERG.Overexpression of miR-196bpromoted proliferation,migration,and invasion of LUAD cells(P 0.05).Rescue experiments confirmed that miR-196b/ERG regulatory axis can affect the proliferation,migration,and invasion of LUAD cells(P 1.5,FDR 1.5,FDR 0
8、.05)。1.3细胞培养本研究使用的细胞系均购自北纳生物公司,在 37,5%CO2的条件下培养,培养条件与Zhang 等16相同。各细胞使用的培养基,见表 1。84昆明医科大学学报第 44 卷表1研究使用的细胞系及培养基Tab.1Celllinesandmediausedinthestudy细胞系编号培养基BEAS-2BBNCC338205DMEM-HPC-9BNCC340767HCC-78BNCC338064RPMI-1640H1395BNCC255519Calu-3BNCC3385141.4细胞转染实验方法参考 Sheng K 等17。利用 Lipofecta-mine 3000 试 剂
9、盒 将 miR-196b-mimic、NC-mimic、miR-196b-inhibitor、NC-inhibitor 转 染 到HCC-78 细胞系中,使用定量 qRT-PCR 确定转染是否成功。同样,利用 Lipofectamine 3000 试剂盒将 oe-ERG、oe-NC 转染到 HCC-78 细胞系中,使用定量 qRT-PCR 或 Western blot 分析确定转染是否成功。1.5实时荧光定量 PCR使用 Trizol 试剂盒从 LUAD 细胞中提取总RNA。miRNA 和 mRNA 通过 PrimeScript RT 试剂盒逆转录成 cDNA。qRT-PCR 由 SYBR P
10、remix ExTaq 在 Applied Biosystems ABI 7500 实时 PCR 系统下进行。使用 GAPDH 作为 ERG 内源性参照,U6 作为 miR-196b 的内源性参照;引物序列,见表 2,所有检测结果均采用 2-Ct值的方法进行分析18。1.6蛋白质印迹法将细胞在含有 1%蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解缓冲液中裂解。在 4 下以 16000 r/min 离心20 min 后,用 BCA 蛋白测定试剂盒对总蛋白进行定量,然后在 98 下变性 10 min。通过 SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白质,然后将其转移至聚偏二氟乙烯膜,在含有 0.1%Tween 20(TB
11、ST)的配制的 5%脱脂牛奶中封闭 1 h,随后,将膜与一抗 ERG,GAPDH 在 4 下过夜孵育。第 2 天用 TBST 在室温下洗涤 3 次后,将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗 IgG 在室温下孵育 2 h,然后使用 TBST 洗膜 3 次。最后通过使用增强的化学发光发色底物进行发光反应,并使用 Image Lab 软件进行分析19。1.7细胞增殖实验将 HCC-78 以每孔 3000 个细胞的密度接种到 96 孔板中。分别在培养时间 0 h、24 h、48 h或 72 h 时,将细胞与 MTT 溶液相互作用 4 h,弃去上清液,添加 100 L 二甲基亚砜溶解甲瓒。使用酶标仪检测 570
12、 nm 处的吸光度20。1.8划痕愈合实验将转染的 HCC-78 细胞以 1105的细胞密度接 种 在 6 孔 板 中 并 生 长 至 80%融 合。使 用200 L 移液器吸头沿直线划伤单层细胞。通过PBS 洗涤去除细胞碎片,随后将划伤的细胞在无血清培养基中培养。在划痕后 0 h 和 48 h 使用显微镜拍摄图像并记录划痕宽度21。1.9Transwell 实验对于迁移测定,将 2104个细胞悬浮在无血清培养基中并接种于上层小室,下室填满 30%FBS 培养基。对于侵袭测定,根据制造商的方案,用基质胶包被上室,然后加入含 2104个细胞的无血清培养基,下室填满 30%FBS 培养基22。最后
13、,在显微镜下分别计数用 0.1%结晶紫染色的迁移和侵袭细胞并拍照。1.10双荧光素酶实验将含有 miR-196b 假定结合位点的 ERG 的 3非翻译区(untranslated region,UTR)以及对应的突变序列插入到载体 pmiRGLO 中,构建 pmiRGLO-ERG-WT、pmiRGLO-ERG-MUT。根据制造商的规 程,使 用 Lipofectamine 3000 将 ERG-WT 或ERG-MUT 与 miR-mimic 或 miR-NC 共 转 染 到HCC-78 细胞中。转染 48 h 后,使用荧光素酶测定系统检测荧光素酶活性23。1.11统计学处理平均值标准偏差(SD
14、)所有统计分析均由 GraphPad Prism 6.0 进行。数据表示为,通过t检验或单向方差分析(两两比较采用最小二乘法)用于比较组间差异。P 0.05 被认为差异具有统计学表2引物序列表Tab.2PrimerSequenceTable基因引物序列(53)miR-196bForwardprimer:GTACCACTTTATCCCGTTCACCAReverseprimer:ATCTCGAGGCAGGGAGAGAGGAATAAU6Forwardprimer:GCCCATCTTGACCCGAATReverseprimer:AACGCTTCACGAATTTGCGTERGForwardprimer:
15、GAGTGGGCGGTGAAAGAATAReverseprimer:GGAGATGTGAGAGAAGAGTGGAPDHForwardprimer:CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGCReverseprimer:CCCAATACGACCAAATCCGTT第 10 期刘邦卿,等miR-196b 靶向 ERG 促进肺腺癌的增殖和迁移85意义。2结果2.1在肺癌组织中miR-196b 高表达,ERG 低表达为预测肺腺癌中的差异表达基因,基于TCGA-LUAD 进行差异分析。肺腺癌的 miRNA 表达量数据和临床数据分析结果显示,miR-196b在肺腺癌组织中表达升高 癌旁样本中的相对表达为(4
16、.4221.045),肿瘤样本中的相对表达为(6.3172.468),见图 1A。以 miR-196b 表达的中位值为界线将 LUAD 患者分为 miR-196b 高表达组和 miR-196b 低表达组,K-M(Kaplan-Meier)曲线分析发现 miR-196b 高表达患者的 5 a 生存率低于 miR-196b 低表达患者(P=0.0016),说明miR-196b 高表达与患者的生存率呈负相关,见图 1B。在得到以上的研究结果后,笔者想进一步了解 miR-196b 的调控机制。基于 TCGA 数据库结合文献24确定研究对象ERG,发现 ERG 在肺腺癌组织中下调 癌旁样本中的相对表达为
17、(11.5440.606),肿瘤样本中的相对表达为(9.3000.844),P=3.50e-17,见图 1C。2.2miR-196b 在肺腺癌细胞中高表达基于以上生信结果,在细胞实验中进一步检测 miR-196b 表达量。结果显示,与 BEAS-2B 细胞(10.08)相比,miR-196b 在 HCC-78、PC-9、H1395、Calu-3 细胞系中的表达均升高 分别为(4.550.23),(2.070.18),(3.140.22)和(2.540.18),(P 0.05)。且在 HCC-78 中升高的最多,见图 2,在后续分析中选用 HCC-78 细胞系做相关的实验。2.3miR-196b
18、 可影响肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭对 miR-196b 进行过表达和敲低处理(miR-mimic,miR-inhibitor),同 时 设 置 对 照 组(NC-mimic,NC-inhibitor)以 研 究 miR-196b 对 LUAD进展的影响。过表达处理后的细胞系中 miR-196b 的表达量(22.711.19)较对照组(10.07)上调(P 0.05),过表达效率为 22 倍;而敲低处理后的细胞系中 miR-196b 的表达量(0.250.03)较对照组表达水平(10.07)下调(P 0.05),达到75%的沉默效率(P 0.05),见图 3A。说明转染结果良好,可以用于后续的
19、实验。为了探究转染处理后细胞增殖能力的变化情况,利用 MTT 实验进行检测,结果显示过表达处理组 72 h 时光密度值为(1.6870.123)与对照组 72 h 时光密度值为(1.2450.108)相比增殖能力上调,而敲低处理组 72 h 光密度值为(0.9250.094)的增殖能力与对照组 72 h 光密度值为(1.2450.108)相比下调,差异具有统计学意义(P 0.05),见图 3B。划痕愈合实验和 Transwell 实验结果表明过表达处理后的细胞系迁移和侵袭能力 划痕愈合率为(35.572.08),迁移细胞个数为(31427),侵袭细胞个数为(28821)与对照组 划痕愈合率为(
20、20.941.73),迁移细胞个数为(20116),侵袭细胞个数为(16611)相比增强,差异具有统计学意义(P 0.05),而敲低处理后细胞系迁移和侵袭能力 划痕愈合率为(18.131.61),迁移细胞个数为(17914),侵袭细胞个数为(1069)与对照组 划痕愈合率为(43.642.51),迁移细胞个数为(29821),侵袭细胞个数为(24912)相比减弱,差异具有统计学意义(P 0.05),1510501.00.80.60.40.20log2(expression)13111291078log2(expression)NormalTumorNormalTumormiR-196b(p=3
21、.51017)hsa-mir-196b(p=4.788102)ERG(p=4.91042)0100300500Time(days)Overall survivalLow expressionHigh expressionABC图1miR-196b 和 ERG 在肺腺癌中的表达情况Fig.1ExpressionofmiR-196bandERGinlungadenocarcinomaA:通过 TCGA 数据库预测 miR-196b 在正常组织和肺腺癌组织中的表达,绿框图表示正常样本(n=46),红框图表示肿瘤样本(n=521);B:肺腺癌患者 miR-196b 表达水平与总生存率的 K-M 分析,
22、红色表示高表达组,蓝色表示低表达组;C:通过 TCGA 数据库预测正常组织和肺腺癌组织中 ERG 的表达,绿框图表示正常样本(n=59),红框图表示肿瘤样本(n=535)。86昆明医科大学学报第 44 卷见图 3C3D。2.4ERG 是 miR-196b 的靶基因笔者搜索 TargetScan 数据库发现,ERG 3-UTR 与 miR-196b 有一段互补序列,见图 4A,推测 ERG 是 miR-196b 的潜在靶基因。双荧光素酶实验结果显示,miR-mimic 降低了转染 ERG 3-UTR WT 的细胞的荧光素酶活性,但不能降低转染 ERG 3-UTR MUT 的细胞的荧光素酶活性,见
23、图 4B。这说明 miR-196b 与 ERG 之间存在物理上的相互作用,即 miR-196b 能靶向结合 ERG。然后探究了 ERG 在各个细胞系的表达情况,结果显示,ERG 的 mRNA 和蛋白表达水平在肺腺癌 细 胞 系 中 下 调 BSEA-2B 细 胞 的 ERG 相 对mRNA 表达水平是(10.09),HCC-78、PC-9、543210Relative expressiong of miR-196bBEAS-2BHCC-78PC-9H1395Calu-3*图2miR-196b 在肺腺癌细胞中的表达情况Fig.2Expression of miR-196b in lung ade
24、nocarcinomacells与 BEAS-2B 组比较,*P 0.05。Relative expressionof miR-196bRelative expressionof miR-196b302520151.51.00.501.52.01.00.501.51.00.503210NC-mimicmiR-mimicNC-inhibitormiR-inhibitorNC-inhibitormiR-inhibitor*AB0 h24 h48 h72 h0 h24 h48 h72 hOD value(570 nm)OD value(570 nm)NC-mimicmiR-mimicCDmiR-NC
25、miR-mimicNC-mimicmiR-mimicNC-inhibitormiR-inhibitorNC-inhibitormiR-inhibitor*0 h48 h0 h48 h403020100Migration rates(%)40503020100Migration rates(%)*NC-mimicMigrationInvationMigrationInvationmiR-mimicNC-mimicmiR-mimicNC-mimicmiR-mimicNC-inhibitormiR-inhibitorNC-inhibitormiR-inhibitorNC-inhibitormiR-i
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