IL-10表达对小鼠脾脏CD4 T细胞亚群相关细胞因子的影响.pdf
《IL-10表达对小鼠脾脏CD4 T细胞亚群相关细胞因子的影响.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《IL-10表达对小鼠脾脏CD4 T细胞亚群相关细胞因子的影响.pdf(5页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、878.Doi:10.13621/j.1001-5949.2023.10.0878宁夏医学杂志2 0 2 3年10 月第45卷第10 期Ningxia Med J,Oct.2023,Vol.45,No.10著IL-10 表达对小鼠脾脏 CD4+T细胞亚群相关细胞因子的影响论李东杰 薛永平,刘丽媛,陆思敏,程锁利?【摘要目的研究应用T细胞特异性慢病毒过表达白细胞介素10(IL-10)或 siRNA片段抑制IL-10后对小鼠脾脏CD4*T细胞亚群的影响。方法磁珠分选试剂分离小鼠初始CD4+T细胞,通过IL-10过表达特异性慢病毒侵染 CD4*T细胞,应用qRT-PCR检测IFN-、IL-4、IL-
2、17 A、Fo x p 3的mRNA表达量,应用流式细胞术分别检测IFN-、IL=4、IL-17 A、Fo x p 3在CD4*T细胞中的分泌比率。应用siRNA干扰片段抑制IL-10,应用qRT-PCR检测IFN-、I L-4、I L-17 A、Fo x p 3的mRNA表达量,应用流式细胞术分别检测IFN-、I L-4、I L-17A、Fo x p 3在CD4*T细胞中的分泌比率。结果过表达IL-10后,IFN-、IL-4、IL-17 A m RNA 水平明显下降(P 0.0 5),Fo x p 3mRNA 表达明显上升(P0.05);IFN=、IL-4、IL-17 A 分泌量均明显降低(
3、P0.05),Fo x p 3分泌量明显增高(P0.05)。I L-10 抑制后,IFN-和IL-17AmRNA表达明显上升(P0.05);I FN-和IL-17A分泌量均明显升高(P0.05)。结论过表达IL-10后抑制Thl、T h 2、T h 17 亚群中的IFN-、IL-4、IL-17 A的表达,对 Treg细胞Foxp3的分泌具有促进作用。IL-10抑制能明显促进IFN-、IL-17 A 的表达。【关键词CD4+T细胞;IL-10;慢病毒过表达;siRNA 抑制中图分类号 R532.14The effect of IL-10 expression on CD4+T cell subs
4、et related cytokines in mouse spleenLI Dongjie,XUE Yongping,LIU Liyuan,LU Simin,CHENG Suoli.1.Department of Clinical Laboratory,Peoples Hospital ofNingxia Hui Autonomous Region,Yinchuan 750002,China;2.Department of Joint Surgery,Peoples Hospital of Ningxia Hui AutonomousRegion,Yinchuan 750002,China;
5、3.The Third Clinical Medical College of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,ChinaCorresponding author:CHENG Suoli,Email:chengsuoli Abstract Objective To study the effect of CD4*T cell subsets in mouse spleen after inhibiting IL-10 by using T cell specif-ic lentiviruses overexpression of IL-10
6、 or siRNA fragments respectively.Methods Magnetic bead sorting reagent was used to isolateinitial CD4*T cells from mouse.IL-10 overexpression specific lentiviruses and Inhibition of IL-10 using siRNA interference fragmentswere used to infect CD4*T cells respectively.The mRNA expression levels of IFN
7、-,IL-4,IL-17A and Foxp3 were tested by qRT-PCR,and the secretion ratios of IFN-,IL-4,IL-17A and Foxp3 were tested by flow cytometry.Results The mRNA levels of IFN-,IL-4,IL-17A were significantly decreased after IL-10 overexpression(P0.05)and the expression of Foxp3 mRNA significantlyincreased(P0.05)
8、.The secretion of IFN-,IL-4,IL-17A significantly decreased(P0.05)and the secretion of Foxp3 signifi-cantly increased(P0.05).After IL-10 inhibition,the mRNA levels of IFN-and IL-17A significantly increased(P0.05),andthe secretion of IFN-and IL-17A significantly increased(P0.05).Conclusion Overexpress
9、ion of IL-10 can inhibite the ex-pression of IFN-,IL-4 and IL-17A,and significantly promote the expression of Foxp3.IL-10 inhibition can significantly promotethe expression of IFN-and IL-17A.Key words CD4+T cell;IL-10;Lentiviruses overexpression;siRNA inhibition白细胞介素10(IL10)是一种多效性细胞因子,在免疫调节和抗炎中发挥重要作
10、用。IL10 具有强大的抗炎作用,确立机体的免疫耐受状态,可以抑制病原体对机体的过度免疫反应 。IL-10 在所【基金项目】宁夏自然科学基金资助项目(2 0 2 2 AAC03367)【作者单位 1.宁夏回族自治区人民医院临床医学检验诊断中心,宁夏银川7 50 0 0 22.宁夏回族自治区人民医院关节外科,宁夏银川7 50 0 0 23.宁夏医科大学第三临床医学院,宁夏银川7 50 0 0 4【作者简介 李东杰(197 2 一),博士研究生,副主任技师,主要从事输血医学和临床免疫学研究。通信作者程锁利,副主任医师,Email:文献标识码 A有固有免疫和适应性免疫应答细胞中均有分泌,但在CD4+
11、T细胞亚群中分泌最常见,特别是Th2和Treg。IL-10 能通过抑制共刺激分子、促炎因子和趋化因子的表达影响巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞的功能。近年来,人们对IL-10的功能研究进一步深人,但仍有许多未解问题2 。有研究认为IL-10抑制促炎因子 IFN-、I L-2、I L-3、T NF-的合成3,但对CD4+T细胞亚群的具体影响仍需要进一步探讨。本研究通过 IL-10 过表达 T细胞特异性慢病毒侵染初始(naive)CD4+T 细胞和 siRNA片段抑制 IL-10 后,分析对小鼠脾脏 CD4T细胞宁夏医学杂志2 0 2 3年10 月第45卷第10 期Ningxia Med J,0Oc
12、t.2023,Vol.45,No.10Th1、T h 2、T h 17、T r e g 亚群中的 IFN-、I L-4、I L-17A、Fo x p 3基因和蛋白表达的影响。1资料与方法1.1 一般资料:雌性 BALB/c 小鼠,6 8 周龄,来自宁夏医科大学动物实验中心。小鼠被安置在温度为(221)、相对湿度为(50 1)%的环境中,光/暗周期为12 h/12 h。动物研究符合宁夏医科大学动物管理机构的规定和指南,并根据国际实验动物饲养管理评估认证委员会(AAALAC)和实验动物使用和管理委员会(IACUC)指南进行。1.2T细胞分离,CD4*T细胞分选小鼠2 只,颈椎脱白处死。将小鼠的脾脏
13、无菌取出,置于无菌的RP-MI1640培养基(Sigma)中,加人10%胎牛血清(FBS)、青霉素(10 0 U/mL)和链霉素(10 0 U/mL)(Si g ma)。按照试剂盒说明书操作,使用脾脏淋巴细胞分离试剂盒(Solarbio Life Sciences,P.R.China)获得淋巴细胞。随后,根据美天旋公司试剂盒说明书操作,应用磁珠分选和小鼠 naive CD4*T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec,德国)分离出小鼠脾脏淋巴细胞初始 CD4+T细胞(应用流式细胞仪检查,纯度大于90%)。初始CD4+T细胞在RPMI1640培养基中培养(37,5%C0,),加入10%胎牛血
14、清和100 U/mL浓度的青霉素和链霉素。1.3应用qRT-PCR和流式细胞术检测 IFN-IL-4、I L-17 A、Fo x p 3的表达1.3.1制备IL-10过表达T细胞特异性慢病毒载体:IL-10(Gene ID 16153,NM_010548.2,537 bp)过表达T细胞特异性慢病毒包装(绿色荧光)。通过检测 NCBI数据库,获得目的基因小鼠 IL-10 蛋白编码序列,总长达537 bp,被翻译氨基酸量为17 8 个。目的载体为 pLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-Zs-Green-T2A-PURO 载体。慢病毒载体系统由慢病毒载体系列、psPAX2载体和pMD2G载体三
15、质粒组成。2 93T细胞是慢病毒的包装细胞株,其生长培养基是DMEM(内含10%FBS)。通过培养,贴壁细胞经由生长增殖可完成向单层细胞的转变。预先完成供转染之用2 93T细胞的传代(前提为具备良好的细胞培养状态,能够满足后续转染实验所需)。观察细胞密度,发现其汇合率达7 0%8 0%时,启动转染处理;制备脂转complex,脂转complex混匀后于室温中进行15min温育,然后低速滴加到2 9 3T细胞内,最后移至细胞培养箱(37、5%CO,)内进行培养。经过16 h转染,替换为新鲜的完全培养基(内含10%FBS);转染后48 h和7 2 h分别收集2 次慢病毒上清液(48 h收集后置换新
16、鲜完全培养基)。按照实验要求分装病毒,-8 0 冰箱保存。1.3.2慢病毒侵染naive CD4*T细胞:T细胞培养于RPMI1640(10%FBS,1%双抗)培养基中。准备879.12 孔板,将上述小鼠脾脏 naive CD4+T细胞悬液分为3孔(每孔细胞密度约0.510 7 mL),并进行标记,分别为空白(blank)组,阴性对照(OE-NC)组,IL10 过表达(0 EI L10)组。细胞用 10%FBS1640培养基正常培养,生长到90%以上,传代。先离心弃去细胞培养上清液,加2 mL的PBS清洗细胞离心弃去。加7 0 0 L的胰蛋白酶液(0.2 5%),接着放置在COz培养箱内,计时
17、1.5min左右,显微镜下观察细胞形态变圆后轻轻拍打培养皿,使贴壁细胞脱落。加2 mL的10%FBS1640培养基使细胞全部脱落。转移细胞混悬液至经过灭菌处理的离心管内,于室温中离心,转速为7 0 0 r/min,计时3 min。弃去上清液,用1mL的正常培养液重悬,取10 L细胞悬液加1 L的锥虫蓝混匀后,加于细胞计数板进行计数。小鼠CD4*T细胞的活力保证在95%以上,细胞铺6 孔板,每孔约2 10 5个细胞。细胞贴壁后弃上清液,换成完全培养基,加人慢病毒,混匀,培养72 h后收样,用于后续检测。病毒添加量根据下述公式计算,MOI(感染指数)=(病毒滴度病毒量)/细胞量。CD4+T 细胞
18、MOI=100,TLV-m-IL-10-3flag-ZsGreen-PURO慢病毒滴度为1 10 TU/mL,阴性过表达对照病毒 TLV-ZsGreen-PURO 滴度为 1 10 TU/mL。将上述细胞在6 孔板中配置2 mL的约2 10 s个/孔的T细胞悬液。把培养板移至培养箱内,接受24h预培养(培养条件为5%CO2、37)。后续按照实验所需分组进行IL-10过表达T细胞特异性慢病毒侵染,侵染7 2 h后收样。转入到提前包被好的anti-CD3的12 孔板中,各孔加人antiC D 2 8 稀释液10 L。在37 温箱孵育48 h。后续进行qRT-PCR和流式细胞术检测。各组实验独立重复
19、3次,每组各指标有2 次重复。1.3.3qRT-PCR:根据试剂盒说明书操作,使用Trizol试剂(Invitrogen)从小鼠脾脏CD4*T细胞中提取总 RNA,使用 TB GreenTM Advantage qPCR Premix(T a k a r a)试剂盒进行反转录定量PCR(q RT PCR)反应。小鼠PCR引物应用NCBI网站上的Primer-BLAST工具设计。所有的mRNA表达都应用 GAPDH基因做内参。基因序列见表1。qRT-PCR 结果用 2 -AACi法计算。表1qRT-PCR基因引物序列基因前置引物(5-3)IFN-YGCCACGGCACAGTCATTGAIL-4A
20、TCATCGGCATTTTGAACGAGGIL-17ATTTAACTCCCTTGGCGCAAAAFoxp3ACCATTGGTTTACTCGCATGTGAPDHCCATGTTTGTGATGGGTG反向引物(5-3)TGCTGATGGCCTGATTGTCTTTGCAGCTCCATGAGAACTACTTTCCCTCCGCATTGACACTCCACTCGCACAAAGCACTTCCTTCTTGATGTCATCATAC880.1.3.4T细胞分化:在96 孔板的每孔中,在37(含5%C0,)的完全16 40 培养基中培养初始的CD4*T细胞(约510 个细胞/孔)。4 h后,在48孔板中分别使用4 种不
21、同的细胞因子组合将小鼠CD4+T细胞分化为T细胞的4种亚群,即Th1、T h 2、Th17 和 Treg。对于 Th1 细胞分化,应用包被的 CD3抗体(1 g/mL)和可溶性CD28抗体(1 g/mL)、IL-2(20 ng/mL)、I L-12(50 n g/m L)和抗 IL-4 抗体(10 ng/mL,BD)培养细胞7 2 h。对于 Th2细胞分化,用1 g/mL包被的 CD3抗体、1 g/mL抗CD28、20 ng/mL IL-2、10 n g/m L IL-4(BD)和 10 ng/mL抗IFN-处理细胞7 2 h。为了使细胞分化成Th17细胞,应用包被的 CD3 抗体(1 g/m
22、L)和可溶性CD28 抗体(0.2 g/mL)、T CF-(5 ng/mL)IL-6(100 ng/mL)、抗 IFN-(10 n g/m L)、抗 IL-4(10 ng/mL)和 IL 2 3(50 n g/m L,BD)培养细胞72 h。对于调节性 T(Treg)细胞,应用包被的 CD3 抗体(1 g/mL)和可溶性CD28抗体(0.2 g/mL)、IL-2(20 ng/mL)和 TGF-1(50 ng/mL,BD)培养细胞7 2 h。1.3.5流式细胞仪检测:为了进行细胞内染色,在染色前用细胞刺激剂(Cell StimulationCocktail)加蛋白转运抑制剂(Protein Tr
23、ansportation Inhibitors,Invitrogen公司)刺激细胞6 h。为了检测IFN、IL-4、I L-17 A 和Foxp3在CD4*T细胞中的细胞内表达,按照试剂盒的说明,使用细胞固定/破膜试剂(Invitrogen公司)对细胞进行固定、破膜(细胞浓度约0.510/孔)。应用抗CD4(货号552 0 51)和抗CD3抗体(货号56 2 2 8 6)对细胞进行染色,然后用Invitrogen公司的固定缓冲液在4暗室中固定30 min。应用Invitrogen公司的破膜缓冲液(1x)对细胞进行破膜,然后用标记荧光色素的抗IFN(货号M1001160 9A)、抗IL4(货号8
24、 1112 60-25)、抗IL-17A(货号192 9432)和抗Foxp3(货号56 0 414)抗CD25抗体(货号0 7 312-8 0 25,BD)染色。用BD FACSCalibur流式细胞仪(BD)对染色细胞进行检测,用FlowJoX软件(Tree-star,Inc.)分析结果。1.4 IL-10抑制后检测 IFN-、I L-4、I L-17 A、Foxp3的基因和蛋白水平表达:准备48 孔板,将上述磁珠分选后得到的小鼠脾脏 naive CD4+T细胞悬液(每孔细胞密度约0.510 7 个/mL)进行标记,分别为阴性对照组,IL-10 抑制组(siRNA 基因干扰组)。由上海吉玛
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- IL-10表达对小鼠脾脏CD4 T细胞亚群相关细胞因子的影响 IL 10 表达 小鼠 脾脏 CD4 细胞 相关 细胞因子 影响
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。