FAD依赖的葡萄糖脱氢酶多拷贝毕赤酵母菌株的构建及高效表达.pdf
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1、基金项目:河北省科学院科技计划项目()河北省科学院高层次人才培养与资助项目()河北省科学院高层次人才培养与资助项目()作者简介:董聪 女助理研究员 研究方向为酶制剂:.收稿日期:依赖的葡萄糖脱氢酶多拷贝毕赤酵母菌株的构建及高效表达董 聪 王 玥 罗同阳 高庆华 王庆庆(河北省微生物研究所有限公司河北 保定)摘 要 通过体外多拷贝构建实现 依赖的葡萄糖脱氢酶()在毕赤酵母()菌株中的高效表达 将前期构建的经密码子偏好性优化 基因插入到 质粒中通过同尾酶法酶切酶连构建含 个表达盒的重组表达质粒分别电转至毕赤酵母 中成功筛选到各种重组菌株 测定结果表明载体所含的表达盒数目与嵌合进毕赤酵母基因组中的
2、基因拷贝数之间存在正相关关系 重组菌在试管水平用甲醇诱导 酶活达到最高其中 拷贝的转化子表达水平最高选择 拷贝和 拷贝转化子进行 发酵罐扩大培养 拷贝菌株诱导 酶活达到最高./拷贝菌株诱导 酶活达到最高 ./比 拷贝酶活提高.结果表明通过增加目的基因拷贝数策略有助于提高 的表达量为其进一步扩大生产提供参考关键词 依赖的葡萄糖脱氢酶多拷贝重组菌株高效表达毕赤酵母中图分类号 文献标识码 文章编号 ():./.(.)().()././.微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 .依 赖 的 葡 萄 糖 脱 氢 酶()(.)是一类以 为辅基催化 葡萄糖氧化生成葡萄糖酸内酯的氧化还原酶广泛应用于血糖检测、新型
3、燃料电池、植入式心脏起搏器等领域特别是在血糖检测方面由于 不利用氧作为电子受体故不受血液氧分压影响适用于检测静脉血、动脉血和高海拔等氧含量不同的样本 基于 的血糖计不依赖于氧对红细胞压积的干扰小对麦芽糖、木糖等不敏感避免了其他糖类干扰产生错误结果影响治疗近年来成为便携式血糖监测系统的研究热点 毕赤酵母()表达系统是目前使用最多和最广泛的外源蛋白表达的工具之一 在毕赤酵母表达系统中有过实现可溶表达的报道 周利伟、杨愈丰、等、郭坚等将 在毕赤酵母中成功表达且进行了结构、酶学性质等一系列研究 但是上述研究在构建重组表达菌株时转入的都是含单拷贝基因的表达载体转化毕赤酵母后表达 能力有限 诸多研究表明提
4、高蛋白表达的方法有很多提高基因拷贝数尤为重要 等为提高成熟肽 的表达量利用同尾酶法成功构建最高含 个目的基因拷贝数的毕赤酵母重组菌株 等为提高腐生子囊菌()防御素()的表达量构建了包含 拷贝表达盒的重组表达载体其在毕赤酵母中的表达量是单拷贝表达量的 倍 吕星星等构建了鳜鱼 防御素 拷贝、拷贝重组表达菌株在毕赤酵母中提高了表达量 王义春等构建含 个玉米赤霉烯酮降解基因表达盒的表达质粒获得 降解酶重组菌株 拷贝的转化子表达水平最高三角瓶发酵 酶活达到 /近年来我们通过密码子优化等方法构建了含单个表达盒的产 依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母/在 发酵罐水平经甲醇诱导表达后酶活为./且该酶具有良好的酶
5、学性质 本研究旨在前期研究的基础上利用同尾酶法构建基因的多拷贝表达盒载体策略构建基因多拷贝重组表达菌株同时通过 分析确定各重组菌株基因中目的基因拷贝数以考察研究不同拷贝数对酶活表达的影响以期实现高效表达 材料与方法.材料.菌株和载体 大肠埃希菌()购自天根生化科技有限公司(北京)酵母表达菌株、毕赤酵母()由中科院微生物研究所提供质粒 由河北省微生物研究所有限公司分子生物学实验室(本实验室)前期构建质粒 购自淼灵生物.培养基及显色液 大肠埃希菌 培养基、毕赤酵母、培养基见 公司毕赤酵母操作手册 发酵培养基:胰蛋白胨 酵母提取物 酪蛋白水解物 山梨醇 灭菌 培养基:胰蛋白酶 /酵母提取物 /磷酸氢
6、二钾/磷酸二氢钾./加水至 灭菌 温度下降至 之后超净台加入 过滤除菌 (./)过滤除菌 生物素(/)甲醇 基础盐培养基:磷酸.硫酸钙 /硫酸钾./硫酸镁./氢氧化钾./甘油 /培养基:葡萄糖 琼脂粉 灭菌后加入 和 生物素.培养基:琼脂粉 灭菌后加入 、生物素.和.甲醇 平板筛选显色液:溶液:浓度为 /的 二氯靛酚钠 溶液:葡萄糖(葡萄糖溶于 去离子水中)将 的 的琼脂糖溶化后加入 溶液 溶液即为显色液(现用现配).主要试剂与仪器设备 聚合酶、限制性内切酶(、)、虾碱性磷酸酶 和 连接酶等购自 公司 分子量标准购自康为生物科技 公 司 试 剂 购自北京百灵克生物科技有限公司质粒提取试剂盒购自
7、全式金生物科技公司酵母 提取试剂盒、胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司(北京)博来霉素 购自索莱宝生物科技有限公司(分子级)购自酷来 期 董 聪等:依赖的葡萄糖脱氢酶多拷贝毕赤酵母菌株的构建及高效表达 搏生物科技有限公司生物素购自博奥拓达生物有限公司 购自 其余试剂为分析纯 引物合成和测序由北京中科希林生物科技有限公司完成 电泳仪(北京凯元信瑞仪器有限公司)扩增仪(北京东胜创新生物科技有限公司)紫外凝胶成像仪(北京原平皓生物科技有限公司)实时荧光定量 仪(美国 公司)电击转化 仪(美 国 公司)紫外分光光度仪(上海仪电仪器)恒温振荡摇床(上海智诚公司)发酵罐(上海洋格设备公司).方法.重组表
8、达载体 的构建 将本实验室保藏的重组质粒 和 分别进行 和 双酶切胶回收目的片段酶切产物利用 连接酶进行连接转化到.酶切鉴定阳性克隆并送至中科希林生物科技有限公司进行测序.点突变 由于 基因序列有 酶切位点不利于后期同尾酶法构建基因多拷贝菌株所以需要设计引物将 位点由 突变为 引物序列为:():()用 连接酶进行 扩增程序:退火温度分别设为、延伸 个循环 延伸 保存 模板用之前构建的 质粒 结果用 酶消解热激转化 感受态分别涂布于 平板上 过夜培养 分别挑取单菌落于 液体培养基中培养提取质粒进行 和 双酶切验证酶切正确的送测序进一步验证确认.依赖的葡萄糖脱氢酶基因的多拷贝表达载体的构建 多表达
9、盒载体的构建如图 所示 具体如下:质粒 经、双酶切回收表达框与经 单酶切、去磷酸化回收质粒酶连将连接产物转化至大肠埃希菌感受态 中筛选阳性克隆子后进行试剂盒提质粒即得到 依赖的葡萄糖脱氢酶两拷贝重组表达载体 将两拷贝重组表达载体 分别进行图 拷贝载体构建.微 生 物 学 杂 志 卷、双酶切和 单酶切、去磷酸化然后分别将酶切产物切胶回收将表达框片段和线性化的重组表达载体片段用 连接酶连接将连接产物转化至大肠埃希菌感受态中筛选阳性克隆子即得到 拷贝的重组表达载体 两拷贝载体单切线性化与单拷贝的表达框连接得到 拷贝的重组表达载体.多拷贝酵母表达菌株的构建及验证将构建成功的不同拷贝数重组载体质粒进行
10、线性化后分别电转表达宿主 感受态构建重组菌株电转条件:快速加入 预冷的 液体培养基然后置于 培养箱静置培养 /离心 弃上清用 生理盐水洗 次然后将菌液涂布在 /的 平板上 培养 获得转化子 首先采用平板褪色筛选方法对转化子进行初筛 用无菌牙签将 平板上长出来的转化子复制到具有相同编号的 和 平板上将平板置于 培养箱培养 后取出将显色液倾倒于 平板上室温 即可发生褪色反应阳性菌株在平板上可以将 的蓝色退去出现褪色圈据此确定阳性率根据褪色圈大小初步定性确定酶活大小 根据褪色反应筛选出阳性克隆每种菌株随机挑选 个转化子提取基因组 利用实时定量()的方法检测各转化子中目的基因的拷贝数 所用引物见表 选
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