LNCRNA8975-1对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖周期和迁移的影响及其机制.pdf
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1、35中国美容医学2023年8月第32卷第8期 Chinese Journal of Aesthetic Medicine.Aug.2023.Vol.32.No.8论 著LNCRNA8975-1对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖周期和迁移的影响及其机制詹明峰,张文娟,孙士芳,尚佩生,沈晓峰(新疆医科大学第五附属医院皮肤科 新疆 乌鲁木齐 830000)摘要目的:探讨长链非编码RNA 8975-1(Long non-coding RNA 8975-1,LNCRNA8975-1)通过微小RNA-203(microRNA-203,miR-203)/血管内皮生长因子-A(Vascular endothelial
2、growth factor-A,VEGF-A)信号轴对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(Human keloid fibroblast,HKF)的细胞增殖周期和迁移的影响及其机制。方法:培养人皮肤成纤维细胞(Human skin fibroblasts,HSF)和HKF,采用定量PCR(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)及western blot法检测LNCRNA8975-1、miR-203和I型胶原蛋白(Type I collagen,Col-I)的表达量。将HKF细胞分为Control组、小干扰RNA载体的阴性对照(the negative con
3、trol for small interfering RNA vector,siNC)组、沉默LNCRNA8975-1的小干扰RNA载体(the small interfering RNA vector for silence of LNCRNA8975-1,siLNCRNA8975-1)组、pcDNA3.1空载体(the empty pcDNA3.1 vector,pcDNA)组、过表达LNCRNA8975-1的pcDNA3.1载体(overexpression of LNCRNA8975-1 in the pcDNA3.1 vector,pcDNA-LNCRNA8975-1)组、miR-2
4、03拟似物的阴性对照(the negative control of miR-203 mimic,NC mimic)组、miR-203的拟似物(miR-203 mimic)组、miR-203抑制剂的阴性对照(negative control of miR-203 inhibitor,NC inhibitor)组、miR-203的抑制剂(miR-203 inhibitor)组、siLNCRNA8975-1+miR-203 inhibitor组、VEGF-A+miR-203 mimic组。CCK-8法检测细胞增殖活性,免疫荧光检测细胞周期标志物细胞周期蛋白D1(cyclin D1),伤口愈合实验和
5、Transwell实验检测细胞迁移功能。荧光素酶基因报告实验检测HKF细胞中LNCRNA8975-1和miR-203、miR-203和VEGF-A的直接作用。结果:与HSF相比,HKF中LNCRNA8975-1和Col-I表达量上调(P0.05),而miR-203降低(P0.05)。与siNC相比,siLNCRNA8975-1抑制了HKF细胞周期蛋白cyclin D1表达和细胞的迁移(P0.05)。与NC mimic相比,miR-203 mimic抑制了HKF中cyclin D1蛋白表达和细胞的迁移(P0.05)。LNCRNA8975-1充当miR-203的“分子海绵”靶向抑制miR-203,
6、且VEGF-A是miR-203的靶基因。VEGF-A表达被miR-203 mimic抑制(P0.05)。miR-203 inhibitor充分逆转了siLNCRNA8975-1对HKF中cyclin D1表达和迁移的抑制作用(P0.05),而且VEGF-A则逆转了miR-203 mimic对HKF中cyclin D1表达和迁移的抑制功能(P0.05)。结论:LNCRNA8975-1通过抑制miR-203上调VEGF-A调控HKF的周期和迁移。关键词长链非编码RNA 8975-1;微小RNA-203;血管内皮生长因子-A;瘢痕疙瘩;成纤维细胞;细胞周期;迁移中图分类号R619+.6 文献标志码A
7、 文章编号1008-6455(2023)08-0035-06Effect of LNCRNA8975-1 on Proliferation Cycle and Migration of Keloid Fibroblasts and Its MechanismZHAN Mingfeng,ZHANG Wenjuan,SUN Shifang,SHANG Peisheng,SHEN Xiaofeng(Department of Dermatology,the Fifth Affi liated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830000,
8、Xinjiang,China)Abstract:Objective To study the effect of long non-coding RNA 8975-1(LNRNA8975-1)on cell proliferation cycle and migration of keloid fi broblasts and to explore the mechanism.Methods Human skin fi broblasts(HSF)and keloid fi broblasts(HKF)were cultured.The expression levels of LNCRNA8
9、975-1,miR-203 and Col-I were detected by qPCR and western blot.HKF cells were divided into Control group,siNC group,siLNCRNA8975-1 group,pcDNA group,pcDNA-LNCRNA8975-1 group,NC mimic group,miR-203 mimic group,NC inhibitor group,miR-203 inhibitor group,siLNCRNA8975-1+miR-203 inhibitor group,VEGF-A+mi
10、R-203 mimic group.Cell proliferation activity was detected by CCK-8 assay,cell cycle marker cyclin D1 was detected by immunofluorescence,and cell migration function was detected by wound healing assay and Transwell assay.Luciferase gene reporter assay detected the direct effects of LNCRNA8975-1 and
11、miR-203,miR-203 and VEGF-A in HKF cells.Results Compared with HSF,the expressions of LNCRNA8975-1 and Col-I in HKF were up-基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金(编号:2020D01C226)通信作者:沈晓峰,主任医师、硕士研究生导师;研究方向为皮肤肿瘤的发病机制和治疗。E-mail:第一作者:詹明峰,硕士研究生;研究方向为皮肤病的激光治疗。E-mail:36中国美容医学2023年8月第32卷第8期 Chinese Journal of Aesthetic Medicin
12、e.Aug.2023.Vol.32.No.8regulated(both P0.05),while miR-203 was down-regulated(P0.05).Compared with siNC,siLNCRNA8975-1 inhibited the expression of HKF cyclin D1 and cell migration(all P0.05).Compared with NC mimic,miR-203 mimic inhibited cyclin D1 protein expression and cell migration in HKF(P0.05).L
13、NRNA8975-1 acts as a molecular sponge for miR-203 to target inhibition of miR-203,and VEGF-A is a target gene of miR-203.VEGF-A expression was inhibited by miR-203 mimic(P0.05).miR-203 inhibitor fully reversed the inhibitory eff ect of siLNCRNA8975-1 on the expression and migration of cyclin D1 in H
14、KF(P0.05),and VEGF-A reversed the inhibitory eff ect of miR-203 mimic on the expression and migration of cyclin D1 in HKF(P0.05).Conclusion LNRNA8975-1 regulates the cycle and migration of keloid fi broblasts by inhibiting miR-203 and up-regulating VEGF-A.Key words:long non-coding RNA 8975-1;microRN
15、A-203;vascular endothelial growth factor-A;keloid fi broblasts;cell cycle;migration过度瘢痕形成可进展为瘢痕疙瘩1-2,这与人瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长、细胞周期进程和细胞迁移的调控密切相关,但其内在机制并不清楚3。lncRNA可通过“分子海绵”作用吸附微小RNA,进一步通过调控靶mRNA的表达从而调控细胞的增殖、周期进程、细胞的迁移和侵袭等4-7。最近研究表明LNCRNA8975-1在瘢痕疙瘩中明显高表达8,但其在瘢痕疙瘩中的作用不清楚。经预测发现miR-2039是LNCRNA8975-1潜在靶基因,而VEGF-
16、A则是miR-203在肿瘤细胞中的靶基因10。然而,LNCRNA8975-1调控的miR-203/VEGF-A网络是否介导HKF的细胞周期蛋白D1(cyclin D1)表达和细胞迁移等并不清楚。本研究旨在探讨长链非编码RNA8975-1通过微小RNA-203/血管内皮生长因子-A信号轴对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞增殖周期和迁移的影响及其机制,现报道如下。1 材料和方法1.1 试剂和耗材:HSF和HKF购自购于武汉普诺赛生命科技有限公司。人重组VEGF-A蛋白(VEGF-A)购于英国Abcam公司。沉默LNCRNA8975-1的阴性对照(si-NC)、沉默LNCRNA8975-1的小干扰RNA载
17、体(siLNCRNA8975-1)、pcDNA3.1空载体(pcDNA)、pcDNA3.1-LNCRNA8975-1过表达载体(pcDNA-LNCRNA8975-1)、miR-203拟似物(mimic)的阴性对照(NC)(NC mimic)、miR-203 mimic、miR-203抑制剂(inhibitor)的阴性对照(NC)(NC inhibitor)、miR-203 inhibitor、pGL3-LNCRNA8975-1-WT载体以及pGL3-LNCRNA8975-1-Mut载体都构建于上海吉玛公司。I型胶原蛋白(Type I collagen,Col-I)的一抗(ab6308)购于英国
18、Abcam公司,VEGF-A(12534)、磷酸化(p-)VEGF-A(9516)、cyclin D1、磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(5174)购于美国Cell Signaling Technology公司。AlexaFluor594偶联的山羊抗兔二抗购于美国ThermoFisher公司。二脒基苯基吲哚(Diaminidine phenyl indole,DAPI)购于美国VectorLaboratory公司。1.2 细胞培养:HSF和HKF在补充有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100g/ml链霉素的杜氏
19、改良培养基(Dulbeccos modified eagle medium,DMEM)中培养。在37下,细胞在含有95%空气和5%CO2的湿润培养箱中培养,每1 d换液1次。将汇合率达到70%的对数生长期细胞用于后续实验。1.3 H K F 细 胞 的 瞬 时 转 染 和 分 组 处 理:s i N C 组、siLNCRNA8975-1组、pcDNA组、pcDNA-LNCRNA8975-1组、0 NC mimic组、miR-203 mimic组、NC inhibitor组、miR-203 inhibitor组的细胞的处理方法如下,当HKF细胞生长到70%汇合率时,联合Lipofectamine
20、 2 000分别加入10 nmol/L siNC、siLNCRNA8975-1、pcDNA、pcDNA-LNCRNA8975-1,0.8mol/L的NC mimic、miR-203 mimic、NC inhibitor、miR-203 inhibitor,并在37下孵育24 h。而siLNCRNA8975-1+miR-203 inhibitor组为联合Lipofectamine 2 000共同加入10 nmol/L siLNCRNA8975-1和0.8mol/L miR-203 inhibitor,并在37下孵育24 h。而VEGF-A+miR-203 inhibitor组为联合Lipofec
21、tamine 2 000共同加入10 nmol/L人重组VEGF-A蛋白和0.8 mol/L miR-203 inhibitor,并在37下孵育24 h。Control组细胞不进行任何处理。收集细胞用于后续检测。1.4 qPCR:收集各组细胞超声裂解后,根据制造商的方案,将细胞转移到含有Trizol的试管中,分离总RNA。用DNase I处理1g总RNA,根据生产上说明进行逆转录。并根据制造商的说明,使用SYBR Green PCR进行qPCR分析。在96孔光学反应板中进行40个循环进行PCR扩增,1个循环中94C 30 s、5863C 30 s、72C 60 s。对于mRNA用GAPDH作内
22、参基因。获得相对于Control组数值的倍数变化。使用以下引物:GAPDH(内参)正向引物5-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3,反向引物5-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3;LNCRNA8975-1正向引物5-CGGCTAACAAGGAGATTTGG-3,反向引物5-AGGCTCAGGGATGGTAGTCC-3;miR-203正向引物5-TAAGGCACGCGGTGAATGCC-3,反向引物5-GATTGAATCGAGCACCAGTTAC-3;VEGF-A正向引物5-TTTCGCTAGCCAACTTTT-3,反向引物5-TATCTGTTTTCAATGTAAGCTC-3。
23、使用2-CT方法分别计算lncRNA和miRNA的靶基因对GAPDH(内参蛋白)和U6(内参蛋白)的相对表达。37中国美容医学2023年8月第32卷第8期 Chinese Journal of Aesthetic Medicine.Aug.2023.Vol.32.No.81.5 蛋白免疫印迹(Western blot):在SDS-PAGE凝胶上分离来自不同样品的等量总蛋白,并用针对Col-I(1500)、VEGF-A(11 000)、p-VEGF-A(11 000)或GAPDH(15 000)在4C孵育过夜,然后用HRP偶联的抗小鼠二抗(15 000)在室温下孵育2 h。用增强的化学发光试剂显
24、色,并使用Image J软件进行分析。1.6 CCK-8:根据生产商提供的说明,于96孔板内处理各组细胞持续24 h、48 h、72 h,随后去除96孔培养板内培养液,每孔避光加入100l含10%CCK-8溶液的DMEM完全培养液,37 孵育4 h后终止培养,摇床室温振荡5 min。在酶标仪上测定450 nm处吸光度值。实验重复3次,取3次实验的均值作为实验结果。1.7 cyclin D1的免疫荧光染色:将细胞固定在4%多聚甲醛中,用0.3%TritonX-100渗透,并用PBS中的1%BSA封闭。与抗cyclin D1抗体(1500)在4C孵育过夜后,细胞用AlexaFluor594缀合的山
25、羊抗兔二抗(1250)染色,并用DAPI染色液染细胞核15 min。使用荧光显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)捕获图像。1.8 伤口愈合实验:将细胞(5104)接种在96孔板中并孵育过夜,以使细胞黏附并生长至汇合层。然后用无菌移液器尖端在细胞单层上划一个1 mm宽的划痕。0 h、24 h和48 h分别对划痕的相同位置进行拍照。使用ImagePro-Plus软件(Media Cybernetics,Rockville,MD)计算0 h、24 h和48 h时间间隔的划痕/伤口宽度。1.9 Transwell迁移实验:细胞以1 105个细胞/孔接种在24孔板中的未包被基质胶Transw
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