LncRNA FEZF1-AS1通过调控EZH2对肺间质细胞增殖、迁移及侵袭的作用.pdf
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1、 年 月第 卷 第 期基础医学与临床 收稿日期:修回日期:基金项目:国家自然科学基金青年科学基金()通信作者():;文章编号:()研究论文 通过调控 对肺间质细胞增殖、迁移及侵袭的作用王春燕,王 萍,宋龙飞,刘永全,满 君 潍坊医学院 临床医学院,山东 潍坊;潍坊医学院附属医院 呼吸内科;康复医学科,山东 潍坊 摘要:目的 研究长链非编码 家族锌指 反义 ()调控 同源物增强子()对肺间质细胞增殖、迁移、侵袭能力及上皮细胞间质转化()的影响及其作用机制。方法 将人肺腺癌细胞系 分为对照组()和模型组,用转化生长因子()作用 ,诱导成为肺间质细胞。用 检测细胞中 钙黏蛋白()、钙黏蛋白()及波形
2、蛋白()的蛋白表达。检测细胞中 和 基因表达。转染组细胞分为转染 组、组和 组。法检测细胞增殖、细胞划痕检测细胞迁移、小室法检测细胞侵袭;用 检测细胞中、及 的蛋白表达,用 免疫沉淀()测定 与 的直接结合作用。结果 与对照组比较,模型组 的蛋白表达水平减少();及 的蛋白表达水平升高();与对照组比较,模型组 与 基因的表达水平明显升高();与 组相比,组细胞增殖、迁移、侵袭能力降低,蛋白表达升高,、蛋白表达降低();与 组比较,组细胞增殖、侵袭、迁移能力升高,蛋白表达降低,、蛋白表达升高();实验进一步证实了 与 具有结合作用。结论 通过调控 促进肺间质细胞增殖、侵袭、转移和 过程。关键词
3、:特发性肺间质纤维化;家族锌指 反义 ();上皮细胞间充质转化();基因增强子同源物();人非小细胞肺癌细胞系 中图分类号:文献标志码:,;,:()(),基础医学与临床 ()()(),(),(),(),(),(),(),(),:;();();();特发性肺间质纤维化(,)是一种病因不明的慢性进行性疾病,以呼吸困难和肺功能进行性恶化为特征,预后差。目前研究认为 发病机制主要与上皮细胞间充质转化(,)有关,指上皮细胞在形态学上发生成纤维细胞表型的转变,细胞极性消失,迁移和侵袭能力增加的现象。长 链 非 编 码 (,)是一类长度超过 的非编码,可通过多种机制调节靶基因的表达。长链非编码 家族锌指 反
4、义 (,)在肿瘤的发生和进展中发挥着重要作用,研究发现 通过调控细胞 过程相关的多种信号通路参与直肠癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤等疾病的病理过程。然而 与肺间质纤维化的相关研究较少,本研究探讨了 调控 基因增强子同源物(,)在 中作用机制,为其治疗提供了依据。材料与方法 材料 细胞:人肺腺癌细胞系()(上海富衡生物科技有限公司)。主要试剂:转化生长因子()(,上海近岸生物科技有限公司);液体培养基(公司);胎牛血清(赛默飞世尔科技中国有限公司);检测试剂盒(,日本 公司);和 试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司);引物合成(上海捷瑞生物工程有限公司);第一链合成试剂盒、试剂盒(广州白薇生物科
5、技有限公司);转染质粒和(对照)转染质粒(广州市锐博生物科技有限公司);(过表达)转染质粒及 对照转染质粒王春燕 通过调控 对肺间质细胞增殖、迁移及侵袭的作用(湖南优宝生物科技有限公司);转染试剂、钙 黏 蛋 白()、钙 黏 蛋 白()、波形蛋白()、及 抗体(公司);偶联的二抗(上海碧云天生物技术有限公司)。方法 细胞的分组及处理:将 细胞分为对照组()和 肺 间 质 纤 维 化 模 型 组(,作用 )。转染组细胞分为转染 组、组及 组,每孔细胞转染量约为,转染后立即加入,后用于后续实验。检测 和 的表达水平:用 试剂根据试剂盒说明从细胞中提取总,按试剂盒说明书操作反转录成,按试剂盒说明进行
6、 反应,反应条件为 ;,个循环。记录 值,采用 进行相对定量分析,以 作为内参计算 和 的表达量。引物序列(表)。表 引物序列 ():法检测细胞增殖:将细胞调整至 ,接种于 孔板,后进行转染,同时加入 ,放置在培养箱中培养,在培养、和 时每孔加入 溶液并在培养箱中孵育 ,使用酶标仪测定 波长下各孔检测的吸光度值。划痕实验检测细胞迁移:将细胞悬液接种到 孔板中,细胞增殖至铺满孔底后,用 的无菌微量移液器吸头垂直在消毒后在细胞板上划痕,并将细胞洗涤 遍,充分洗去漂洗细胞,加入无血清培养基,培养箱中继续培养。倒置显微镜下观察并拍照记录 ,的划痕面积。划痕愈合率()(划痕面积 划痕面积)划痕面积。小室
7、法检测细胞侵袭:制备细胞悬液,将细胞种入 小室中,调整细胞浓度为,每组细胞数量为 个。配置 上室液和下室液:上室加无血清培养基,下室是 含血清完全培养基,上室液每孔 ,下室液每孔 。将上层小室放入下层小室,细胞计数后将细胞铺在上层小室中。细胞培养箱中培养 后,取出上室,用棉签擦去上室底部膜表面上的细胞,缓冲液洗涤后置于 甲醇中固定 ,采用吉姆萨染色液染细胞,荧光倒置显微镜计数、拍照。检测细胞中、波形蛋白的表达:裂解液裂解每组细胞,于 下 离心 ,提取细胞蛋白质,试剂盒测定蛋白质浓度,加入蛋白质上样缓冲液煮沸,放于 保存。电泳分离后,用湿转法转到 膜,加入一抗 孵育过夜,充分洗涤 膜后加入二抗
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