Erastin和BIBR1532联合应用对胃癌细胞增殖的影响.pdf
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1、论 著文章编号(23)6-0575-07基金项目 天津市教委科研计划(2 0 2 1 Z D 0 3 7)作者简介 杨秋慧(1 9 9 8-),女,硕士在读,研究方向:医学生物化学与分子生物学;通信作者:耿鑫,E-m a il:g e n g x tm u.e d u.c n。Erastin 和 BIBR1532 联合应用对胃癌细胞增殖的影响杨秋慧,郝名英,刘思琪,黄欣宇,耿鑫(天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系,天津300070)摘要 目的:探究Erastin和BIBR1532(端粒酶抑制剂)联合应用对胃癌细胞增殖的影响。方法:使用TIMER2.0、GEPIA2.0数据库比较胃癌组
2、织和相应的正常胃黏膜组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)基因的表达水平,并通过GEPIA2.0预测GPX4是否影响胃癌患者的生存和预后。利用STRING数据库构建GPX4蛋白相互作用网络。10、20 mol/L Erastin干扰GPX4表达,通过Western印迹及TRAP(端粒酶活性测定)实验检测TERT蛋白表达量以及端粒酶活性的变化。应用CCK8增殖实验、克隆形成实验检测细胞活力。结果:TIMER2.0和GEPIA2.0数据库检索结果显示胃癌组织中的GPX4表达水平明显高于正常组织,高水平的GPX4与胃癌患者不良预后相关(P0.05)。STRING蛋白相互作用网络分析显示,GPX4蛋白相
3、互作用网络包括TERT、SLC7A11、PINX1、HSP90AA1、DKC1、SLC3A2、SMARCA4、PIF1、CTNNB1、WRAP53、SMG6、RUVBL1。10、20 mol/L Erastin干扰GPX4蛋白表达后,TRAP实验结果显示细胞端粒酶活性明显降低(t=34.29、14.28,均P0.001),Western印迹结果显示TERT蛋白表达量明显降低(t=3.599、8.144,均P0.05)。CCK8和克隆形成实验结果显示细胞生长增殖能力降低(t=8.662、27.88,均P0.001)。10 mol/L Erastin与75 mol/L BIBR1532联合使用导致
4、胃癌细胞端粒酶活性和TERT蛋白表达量进一步降低(t=9.931、4.918,均P0.01),导致细胞增殖能力降低更明显(t=4.157、25.46,均P0.05)。结论:GPX4在胃癌组织中高表达,Erastin和BIBR1532联合使用在干扰GPX4表达的同时,细胞内端粒酶活性和TERT蛋白表达量进一步降低,抑制胃癌细胞增殖。关键词GPX4;胃癌;铁死亡;端粒酶中图分类号R735.2文献标志码Effects of the combination of Erastin and BIBR1532 on the proliferation of gastric cancer cellsYANG
5、Qiu-hui,HAO Ming-ying,LIU Si-qi,HUANG Xin-yu,GENG Xin(Department of Biochemistry and Molecular Biology,School of Basic Medical Sciences,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China)AbstractObjective:To explore the effects of the combination of Erastin and BIBR1532(telomerase inhibitor)on the prol
6、iferationof gastric cancer cells.Methods:Relevant data from TIMER2.0 and GEPIA2.0 databases regarding glutathione peroxidase(GPX4)geneexpression level in gastric cancer samples and corresponding normal gastric mucosal samples were analyzed.GEPIA 2.0 was used to predictwhether GPX4 affects the surviv
7、al and prognosis of gastric cancer(GC)patients.The GPX4 protein interaction network was constructedusing STRING database.GPX4 expression was interfered with 10,20 mol/L Erastin,the changes of TERT protein expression andtelomerase activity were detected by Western blotting and TRAP(telomerase activit
8、y assay)experiments.Cell viability was detectedthrough CCK8 proliferation and clone formation experiments.Results:The results of TIMER2.0 and GEPIA2.0 databases showed thatGPX4 expression level in GC tissues was significantly higher than that in normal tissues,and high GPX4 level was associated with
9、 poorprognosis in GC patients(P0.05).The analysis of STRING protein interaction network showed that GPX4 protein interaction networkincluded TERT,SLC7A11,PINX1,HSP90AA1,DKC1,SLC3A2,SMARCA4,PIF1,CTNNB1,WRAP53,SMG6andRUVBL1.TheresultsofTRAP experiment showed that telomerase activity significantly decr
10、eased after GPX4 expression was interfered with 10,20 mol/LErastin(t=34.29,14.28,both P 0.001).Western blotting results showed that TERT protein expression level was significantlydecreased(t=3.599,8.144,both P0.05).The results of CCK8 and clone formation experiments showed a decrease in cell growth
11、andproliferation(t=8.662,27.88,both P0.001).The combined treatment of 10 mol/L Erastin and 75 mol/L BIBR1532 reduced thetelomeraseactivityandtheexpressionofTERTproteininGCcells(t=9.931,4.918,both P0.01),resultinginamoresignificantdecrease incell proliferation(t=4.157,25.46,both P1,P0.01。同时运用此数据库分析了G
12、PX4 mRNA表达水平与胃癌患者预后的关系,P0.05具有统计学意义。1.2.2细胞培养及传代BG823细胞用含有10%FBS的DMEM培养基培养,培养基中含1%青-链霉素,置于5%CO2、37培养箱中培养,待细胞融合至90%左右,用0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代。1.2.3药物配置10 mg Erastin溶于1.828 mL DMSO中,配制为10 mmol/L储存液。10 mg BIBR1532溶于3.02 mL DMSO中,配制为10 mmol/L储存液。细胞培养液将其稀释为实验所需浓度。1.2.3Western印迹实验取对数生长期BG823接种于6孔板,细胞贴壁后加药处理48 h
13、,将RIPA、磷酸蛋白酶抑制剂、蛋白酶抑制剂以10021配置裂解液,提取细胞总蛋白。使用BCA试剂盒检测蛋白浓度。配置12%的分离胶,在12%SDS-PAGE凝胶上电泳分离等量的蛋白质提取物,电泳后将蛋白转印到PVDF膜,在封闭缓冲液中孵育2 h,随后加入特异性一抗(GAPDH 110 000,SLC7A11 11 000,第29卷天津医科大学学报576GPX4 11 000,TERT 11 000),4孵育过夜,TBST漂洗3次,每次10 min,加入二抗(110 000)室温孵育2 h,TBST漂洗3次使用化学发光试剂进行检测。将目的蛋白与内参的灰度比值作为蛋白的相对表达丰度。1.2.4C
14、CK-8实验取对数生长期BG823细胞接种于96孔板,每组设立6个复孔,细胞贴壁后加药处理48 h,药物处理结束后更换含10%FBS的DMEM培养基。连续检测4 d细胞增殖情况,每天给细胞更换新鲜的培养基100 L并加入10 L CCK-8溶液,敷箱内避光孵育1 h,用酶标仪检测细胞在450 nm处的吸光值并绘制其生长曲线。1.2.5克隆形成实验取对数生长期的BG823细胞接种于六孔板,细胞贴壁后加药持续培养两周,去除培养液,PBS清洗,4%的多聚甲醛固定,然后加入结晶紫染液,常温放置10 min,PBS清洗后拍照,记录实验结果。1.2.6端粒酶活性检测实验每个实验组1106个细胞,PBS洗涤
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