LncRNA NEAT1调控NF-κB信号通路对棕榈酸诱导的LO2细胞损伤与炎症反应的影响.pdf
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1、实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17LncRNA NEAT1调控NF-B信号通路对棕榈酸诱导的LO2细胞损伤与炎症反应的影响许云春 于馨雅 王雅芝 申元英 郭乐大理大学基础医学院(云南大理671000)【摘要】目的探讨lncRNA NEAT1调控NF-B信号通路在棕榈酸诱导的LO2细胞损伤与炎症反应中的作用及机制。方法棕榈酸处理LO2细胞24 h;油红O染色和甘油三酯含量检测脂质积累;CCK8检测细胞活力;ALT、AST 酶活力检测肝细胞受损情况;RT-qPCR 检测 lncRNA NE
2、AT1 的表达;RT-qPCR 和ELISA 检测细胞内和培养液上清中炎症因子 TNF-、IL-1、IL-6 的表达;蛋白质印迹和免疫荧光法检测NF-B信号通路相关蛋白表达。结果棕榈酸处理的LO2细胞中,脂质含量增加,细胞活力降低,肝细胞损伤指标 ALT、AST 酶活性升高,炎症因子 TNF-、IL-1、IL-6 表达增加,同时 lncRNA NEAT1 表达上调(P 0.05)。过表达lncRNA NEAT1后,ALT、AST、TNF-、IL-1、IL-6表达进一步增加,而细胞活力显著降低,沉默 lncRNA NEAT1 则起相反作用(P 0.05)。棕榈酸诱导的 LO2 细胞中 NF-B
3、信号通路被激活,IKB 蛋白降低,NF-B p65 磷酸化入核增加,过表达 lncRNA NEAT1 进一步减少 IKB 并增加 NF-B p65磷酸化入核,沉默 lncRNA NEAT1 则起相反作用(P 0.05)。结论棕榈酸诱导的 LO2 细胞中 lncRNA NEAT1表达上调促进细胞损伤与炎症反应,其机制与激活NF-B信号通路有关。【关键词】lncRNA NEAT1;代谢相关脂肪性肝病;肝细胞损伤;炎症反应;NF-B信号通路【中图分类号】R575.1Effect of lncRNA NEAT1 on palmitic acidinduced LO2 cell injury and i
4、nflammatory response through regulation of NFB signaling pathway XU Yunchun,YU Xinya,WANG Yazhi,SHEN Yuanying,GUO Le.School of Basic Medicine,Dali University,Dali 671000,China Corresponding author:GUO Le Email:【Abstract】ObjectiveTo explore the role and mechanism of lncRNA NEAT1 in palmitic acid-indu
5、ced injury and inflammatory response of LO2 cells by regulating NF-B signaling pathway.MethodsLO2 cells were treated with palmitic acid for 24 h.Oil red O staining and triglyceride(TG)test were done to detect lipid accumulation,CCK8 assay was done for cell viability,and ALT and AST were tested for d
6、etecting hepatocyte injury.The expression of lncRNA NEAT1 was detected by RT-qPCR,the expression of inflammatory cytokines TNF-,IL-1 and IL-6 in intracellular and culture supernatants were determined by RT-qPCR and ELISA and the expression of NF-B signaling pathway-related proteins was detected by W
7、estern blot and immunofluorescence.ResultsIn the palmitic acid-treated LO2 cells,the lipid accumulation was increased,the cell viability was decreased,the levels of ALT and AST were increased.Meanwhile,the expression of inflammatory cytokines TNF-,IL-1 and IL-6 was increased and the expression of ln
8、cRNA NEAT1 was upregulated(P 0.05).After overexpression of lncRNA NEAT1,the levels of ALT,AST,TNF-,IL-1,IL-6 were even more increased,the cell viability was significantly reduced.Contrarily,inhibition of lncRNA NEAT1 resulted in the opposite effect(P 0.05).In addition,NF-B signaling pathway was acti
9、vated in the LO2 cells induced by palmitic acid and IKB expression was decreased and phosphorylation of NF-B p65 was increased.Then the overexpress of lncRNA NEAT1 further promoted the degradation of IKB protein and increased NF-B p65 phosphorylation into the nucleus,and contrarily,inhibition of lnc
10、RNA NEAT1 resulted in the opposite effect(P 200 个核苷酸且不具备蛋白编码功能的RNA分子,它能作为促进转录的信号或抑制转录的诱饵、表观遗传调节因子等参与基因调控9-10,还可以履行分子介质的职责,调节细胞信号通路传导,影响疾病发展11-12。位于11号染色体的核内富集转录本 1(nuclear enriched abundant transcript 1,NEAT1)是核 lncRNA 的一种类型,与趋化因子调节、细胞因子产生和炎症小体激活等炎症反应过程有关,还可以作为转录调控因子激活NF-B 信号通路的转导,该通路被激活促进炎症反应,加剧细胞损
11、伤13。有研究14表明沉默lncRNA NEAT1通过抑制TLR2/NF-B信号通路的激活来改善脂多糖诱导的小鼠心肌损伤和炎症。然而,lncRNA NEAT1是否可以通过调控NF-B信号通路来影响 MAFLD 中肝细胞损伤及炎症反应目前尚不明确,因此,探究其可能存在的调控机制可为 MAFLD 的诊治提供新见解。本研究以棕榈酸处理人正常肝永生化细胞株(LO2)建立MAFLD体外细胞模型,通过脂质体转染实现过表达或者沉默lncRNA NEAT1,探讨其表达水平变化对棕榈酸诱导的LO2细胞损伤与炎症反应的影响,并初步阐明其机制。1材料与方法1.1 材料 胎牛血清、DMEM 培养基(美国 Gibco公
12、司);0.25%胰酶、青链霉素(北京索莱宝科技有限公司);20%无脂肪酸牛血清白蛋白、组织细胞甘油三酯(TG)酶法测定试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司);棕榈酸(西安鲲创科技有限公司);油红 O 染料(上海迈瑞尔化学技术有限公司);第一链cDNA反转录试剂盒及通用型实时荧光定量PCR试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司);lnRcute lncRNA cDNA 第一链合成试剂盒、lnRcute lncRNA荧光定量检测试剂盒(北京天根生化科技有限公司);谷丙转氨酶(ALT/GPT)测试盒、谷草转氨酶(AST/GOT)测试盒(南京建成生物工程研究所);TNF-、IL-6、IL-1 ELISA 试
13、剂盒(北京四正柏生物科技有限公司);Lipo8000TM转染试剂(上海碧云天生物技术有限公司);NF-B p65、p-NF-B p65、IB、GAPDH单克隆抗体(Cell Signaling Technology 公司);过表达质粒 pcDNA-NEAT1(武汉金开瑞生物工程有限公司);小干扰RNA si-NEAT1(genepharma公司)。1.2方法1.2.1 细胞培养、模型建立及分组 使用含 10%胎牛血清、1%青-链霉素的DMEM培养基培养LO2细胞,并将其置于37、5%CO2的培养箱,当细胞密度达80%90%时,消化传代。取对数生长期的细胞进行实验,分为Blank组(空白对照),
14、Vehicle组(溶剂对照),PA组(模型组:添加0.32 mmol/L棕榈酸处理24 h)。设置Control 组(阴性对照组)、PA组(模型组)、pcDNA-NC+PA 组(过表达空载对照组)、pcDNA-NEAT1+PA 组(过表达组)、si-NC+PA组(沉默阴性对照组)、si-NEAT1+PA组(沉默组)。1.2.2 油红 O 染色和甘油三酯(TG)含量测定评估细胞脂质积累 油红 O 染色按照以下步骤进行,细胞处理后,4%多聚甲醛固定30 min,60%异丙醇润洗后使用油红 O 工作液避光染色 30 min,60%异丙醇洗涤后苏木素染液染色2 min,显微镜观察获取图像。TG 含量测
15、定根据试剂盒说明书进行操作,收集细胞进行裂解,使用酶标仪检测波长为550 nm处的吸光度值并根据标准曲线计算TG浓度,再通过BCA 法测定细胞内蛋白浓度,以蛋白浓度校正TG含量。1.2.3 CCK8 检测细胞活力 取对数生长期的LO2细胞接种于96孔板中,分组处理后,每孔加入CCK8溶液10 L,37避光孵育1 h后使用酶标仪检测OD450,细胞活力=(OD 实验组-OD 空白组)/(OD对照组-OD空白组)100%。1.2.4 丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)酶活力测定反映肝细胞损伤 收集各组细胞培养上清液,按照说明书步骤进行操作,波长 510 nm,酶标仪测定各孔
16、 OD 值,以绝对OD 值(OD 测定孔-OD 对照孔)查标准曲线,求得相应的ALT 和AST活力单位。1.2.5 实时荧光定量PCR(qPCR)检测各目的基因mRNA水平 采用Trizol法提取各组细胞总RNA,按照逆转录试剂盒说明书将其逆转录为cDNA,通2165实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17过qPCR检测基因表达变化。采用比较阈值循环法(2-Ct)计算各目的基因的相对 mRNA 表达量,其中以GAPDH的表达作为内参,主要基因引物序列见表1。1.2.6 酶联免疫吸附试验(EL
17、ISA)检测炎症因子蛋白分泌水平 收集各组细胞培养上清液,按照各指标试剂盒说明书进行操作,即刻测量OD450值,并根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。1.2.7 蛋白质印迹(WB)和免疫荧光(IF)检测NF-B信号通路相关蛋白表达 蛋白质印迹按以下步骤进行,细胞处理后加入RIPA裂解液提取总蛋白,使用BCA法进行蛋白浓度测定并定量,选取12.5%SDS-PAGE 凝胶进行电泳,采用湿转法将蛋白转移至 PVDF 膜上,经 5%脱脂奶粉或 5%BSA封闭 2 h,加入一抗 4 孵育过夜,二抗于室温孵育1 h,最后经ECL曝光成像。免疫荧光检测NF-B p65 核转位情况,使用 4%多聚甲醛固定
18、细胞30 min,0.5%Triton X-100 作用 2 min 使细胞膜通透,1%BSA封闭2 h,加入NF-B p65抗体4 孵育过夜,次日室温避光孵育荧光二抗,并用DAPI 染核,最后使用荧光显微镜观察获取图像。1.3统计学方法实验数据采用 GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析,计量资料用均数标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,P 0.05);而 PA 组棕榈酸处理后LO2细胞内脂质明显积累,细胞活力降低,肝细胞损伤指标 ALT、AST 酶活性增高,炎症因子 TNF-、IL-1、IL-6 表达升高(P 0.05),PA组棕榈酸处理后lncRNA NEAT1表达增
19、高(P 0.01),见图2。2.3过表达及沉默 lncRNA NEAT1 转染效果的检测结果显示,与过表达空载对照组(pcDNA-NC+PA)相比,过表达组(pcDNA-NEAT1+PA)lncRNA NEAT1 表达水平进一步增高,与沉默阴性对照组(si-NC+PA)相比,沉默组(si-NEAT1+PA)lncRNA NEAT1表达降低,提示过表达及沉默均成功(P 0.01),见图3。2.4过表达及沉默 lncRNA NEAT1 对棕榈酸诱导的 LO2 细胞损伤与炎症反应的影响结果显示,与过表达空载对照组(pcDNA-NC+PA)相比,过表达组(pcDNA-NEAT1+PA)细胞活力显著降低
20、,肝损伤指标 ALT、AST 和炎症因子 TNF-、IL-1、IL-6 的表达进一步增高;与沉默阴性对照组(si-NC+PA)相比,沉默组(si-NEAT1+PA)细胞活力有所恢复,肝损伤指标、炎症因子水平均下调(P 0.05),见图4。2.5过表达及沉默lncRNA NEAT1对棕榈酸诱导的LO2细胞中NFB信号通路的影响与Control组相比,PA组棕榈酸处理后NF-B信号通路被激活,NF-B抑制蛋白IKB降解,NF-B p65的磷酸化及核转位增加。与过表达空载对照组(pcDNA-NC+PA)相比,过表达lncRNA NEAT1后进一步促进二者变化。与沉默阴性对照组(si-NC+PA)相比
21、,沉默 lncRNA NEAT1则提高了IKB的表达并减少NF-B p65的磷酸化及核转位,见图5。3讨论在MAFLD中,肝脏脂质沉积过多导致脂质代谢紊乱,在长期慢性的脂毒性刺激下,肝细胞出现应激性损伤,肝脏表现出严重的炎症反应,伴随氧化应激增强,炎症介质增加,肝细胞损伤进一步加重15-16。因此,探究能够改善肝细胞损伤和炎症反应等病理生理过程的策略对缓解 MAFLD 的发展尤为重要。越来越多的 lncRNA 被发现在疾病过程中异常表达,它们已被广泛建议作为某些病理环境中的生物标志物和治疗靶点,对临床诊断及疗效判定等方面具有重要价值。LncRNA NEAT1作为其中的一种,被证实与多种肝脏疾病
22、的发病以及病情进展有关,它能够加速肝纤维化和肝细表1引物序列Tab.1Primer sequences引物名称GAPDHNEAT1TNF-IL-1IL-6引物序列(5-3)F:GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAR:GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGTF:CTTCCTCCCTTTAACTTATCCATTCACR:CTCTTCCTCCACCATTACCAACAATACF:GTCAGATCATCTTCTCGAACCR:CAGATAGATGGGCTCATACCF:AAGCTGATGGCCCTAAACAGR:AGGTGCATCGTGCACATAAGF:TCCAGGATGAGGACA
23、TGAGCACR:TTCACCAGGCAAGTCTCCTC2166实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17BlankVehiclePABlankVehiclePAne*0.150.100.050.00TG/protein contents(mmol/mg)BlankVehiclePABlankVehiclePABlankVehiclePA*ns*ns*ns*nsBlankVehiclePABlankVehiclePABlankVehiclePA*ns*nsBlankVehiclePABlan
24、kVehiclePABlankVehiclePA*ns*ns*ns100%90%80%70%60%50%Cell viability806040200ALT(U/L)806040200AST(U/L)43210Relative IL6 mRNA expression2.01.51.00.50.0Relative IL1 mRNA expression20151050Relative TNF mRNA expression806040200TNF(pg/mL)2520151050IL1(pg/mL)3020100IL6(pg/mL)ABCDEFGHIJK注:A,油红O染色检测细胞内脂质积累情况(
25、200);B,TG测定细胞内脂质含量;C,CCK8检测细胞活力;D-E,ALT、AST酶活性测定反映肝细胞损伤情况;F-H,RFqPCR检测炎症因子TNF-、IL-1、IL-6的mRNA水平;I-K,ELISA检测炎症因子TNF-、IL-1、IL-6的蛋白水平。与Blank组比较,ns表示差异无统计学意义,*P 0.01图1棕榈酸处理对LO2细胞损伤及炎症反应的影响Fig.1Effect of palmitic acid treatment on LO2 cell injury and inflammatory responseBlankVehiclePAVehiclens*2.01.51.0
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