IL-6、IL-17、Th17与Treg在诊断新生儿败血症中的价值.pdf
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1、20在线投稿网址http:/m c h c h i n a.x j t u.e d u.c nIL-6、I L-17、T h 17 与Treg在诊断新生儿败血症中的价值曹艳林,龚永禄,何青?,吴建华,陈丽华(1.常德市第一人民医院检验科,湖南常德4150 0 0;2.常德市第一人民医院儿科,湖南常德4150 0 0;3.中南大学湘雅三医院检验科,湖南长沙410 0 13)摘要 目的探讨外周血白细胞介素-6(IL-6)、I L-17、辅助性T细胞17(Th17)与调节性T细胞(Treg)在新生儿败血症治疗前后表达水平的变化。方法收集2 0 2 0 年8 月至2 0 2 2 年1月期间常德市第一人
2、民医院的新生儿败血症患者8 6 例作为观察组,12 9例新生儿非败血症患者作为对照组。检测患儿外周血中IL-6、I L-17、T h 17、T r e g、T h 17/T r e g 的表达水平,比较上述指标在观察组治疗前后和对照组之间的差异,分析其在治疗前的相关性。结果观察组治疗前后和对照组的IL-6、T r e g、T h 17/Treg检测值的差异均具有统计学意义(H值分别为2 8.90 0、9.6 10、6.7 8 0,P0.05)。观察组早产儿治疗后的IL-6、I L-17、Th17/Treg水平均低于治疗前(Z值分别为一2.8 50、一2.150、一3.40 0,P0.05);观
3、察组早产儿治疗后的Treg水平高于治疗前(t=一2.440,P0.05)。观察组足月产儿治疗后的IL-6、T h 17/T r e g 水平均低于治疗前(Z值分别为一4.57 0、一3.0 2 0,P0.05),观察组足月产儿治疗后的Treg水平高于治疗前(Z=一2.6 40,P0.05)。观察组患儿治疗前外周血IL-6、I L-17 与Th17表达水平呈正相关(r值分别为0.50 7、0.7 30,P0.05);IL-6 与Treg表达水平呈负相关(r=一0.336,P0.05)。结论Th17与Treg细胞免疫平衡稳态的打破与新生儿败血症的发生发展密切相关。IL-6介导新生儿败血症Th17与
4、Treg细胞免疫平衡稳态的打破。关键词 白细胞介素-6;白细胞介素-17;辅助性T细胞17;调节性T细胞;败血症;新生儿Doi:10.3969/j.issn.16735293.2023.07.003中图分类号 R174文献标识码 A文章编号16 7 352 93(2 0 2 3)0 7 0 0 2 0 0 8Diagnostic values of IL-6,IL-17,Th17 and Treg for neonatal sepsisCAO Yanlin,GONG Yonglu,HE Qing,WU Jianhua,CHEN Lihua3(1.Department of Laboratory
5、 Medicine;2.Department of Pediatrics,The First Changde Municipal Peoples Hospital,Hunan Changde 4150o0,China;3.Department of Laboratory Medicine,The Third Xiangya Hospital ofCentral SouthUniversity,HunanChangsha 410013,China)Abstract Objective To investigate changes in expression levels of cytokines
6、 interleukin-6(IL-6),interleukin-17(IL-17),helper Tcell 17(Th17)and regulatory T cell(Treg)in peripheral blood and Th17/Treg of neonates with sepsis before and after treatment.Methods 86 neonates with septicemia who were treated in The First Changde Municipal Peoples Hospital from August 2020 toJanu
7、ary 2022 were selected as observation group,and 129 neonates without septicemia in the same period in the same hospital wereselected as control group.The expression levels of IL-6,IL-17,Th17 and Treg in peripheral blood of the neonates were detected.The differences in the five indexes(IL-6,IL-17,Th1
8、7,Treg and Th17/Treg)between the observation group and the control groupbefore and after treatment were compared.The correlations among the five indexes of the neonates in the observation group beforetreatment were analyzed.Results The differences in IL-6,Treg,and Th17/Treg levels before and after t
9、reatment between the ob-servation group and the control group were statistically significant(H=28.900,9.610 and 6.780 respectively,all P0.05).Thelevels of IL-6,IL-17 and Th17/Treg of the premature infants in the observation group after treatment were lower than those beforetreatment(Z=-2.85,-2.150 a
10、nd-3.400 respectively,all P0.05),while the Treg level of the premature infants in the obser-vation group after treatment was higher than that before treatment(t=-2.440,P0.05).The levels of IL-6 and Th17/Treg ofthe full-term infants in the observation group after treatment were lower than before trea
11、tment(Z=-4.570 and-3.020 respec-tively,both Po.05),while the Treg level of the full-term infants in the observation group after treatment were higher than thatbefore treatment(Z=-2.640,P0.05).Before treatment,the expression levels of IL-6 and IL-17 of the neonates in the obser-收稿日期 2 0 2 2 一0 8-0 9【
12、基金项目湖南省自然科学基金面上项目(2 0 2 1JJ3099);常德市科学技术研究与开发资金项目(2 0 19S169)作者简介曹艳林(197 8 一),女,副主任检验师,主要从事临床检验的研究。21ChineseJournal of WomanChildHealthResearchJul.20232023年7 月Vol.34No.7中国妇幼健康研究第34卷第7 期vation group were both positively correlated with the expression level of Th17(r=0.507 and 0.730 respectively,both
13、P0.05);while the expression level of IL-6 was negatively correlated with the expression level of Treg(r=-0.336,P0.05).Conclusion The disruption of Th17 and Treg cellularimmune homeostasis is closely correlated to occurrence and development of neonatal sepsis.IL-6 mediates the disruption of Th17and T
14、reg cellular immune homeostasis in the neonates with sepsis.Key words interleukin-6(IL-6);interleukin-17(IL-17);helper T cell 17(Th17);regulatory T cells(Treg);septicemia(sepsis);neonate新生儿败血症是指病原体侵人新生儿血液循环并生长繁殖而引起的全身炎性反应综合征,从患儿血液、脑脊液等无菌腔隙体液能培养出致病菌 1患儿病情大多比较严重,病死率也较高 2 。该病治疗费用相对较高,对家庭和社会造成了沉重的负担 3。范
15、含笑等 4 研究报道,目前我国新生儿败血症发病率在活产婴儿中占0.1%1.0%,住院新生儿病死率高达10.3%,且发生机制尚不清楚,败血症的早期诊断对提高患儿的预后有重要的临床意义。目前,对于新生儿败血症的实验室诊断、免疫学研究及相关治疗的问题呕待解决。辅助性T细胞17(helper Tcell 17,Th17)和调节性T细胞(regulatoryT,Treg)是当前免疫学研究的热点之一 5。周洋等 6 和Punt等 7 研究发现,Th17/Treg细胞平衡机制及其相关因子的变化,对促进机体清除病原体的人侵和抵制炎症反应发挥了重要作用。而白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)作
16、为免疫调节性细胞因子,不仅参与炎症反应,也介导了Th17与Treg细胞的增殖和分化。Ye等 8 研究发现,IL-6是早期诊断新生儿败血症最具敏感性的炎症指标。我们的前期研究证实:新生儿败血症患儿外周血中IL-6水平出现了明显变化 9。因此,我们推测败血症患儿体内IL-6水平的变化可能打破了患儿的免疫平衡,进而影响疾病的发生发展。为了证实该问题,本研究探讨了外周血中IL-6、IL-17、Th17与Treg细胞在新生儿败血症治疗前后表达水平的变化及临床价值,旨为新生儿败血症的临床诊断及治疗提供科学依据。1资料与方法1.1研究对象收集常德市第一人民医院2 0 2 0 年8 月至2 0 2 2年1月期
17、间确诊为新生儿败血症患者8 6 例作为观察组(其中早产儿47 例,足月儿39例),人选标准按照2019年中华医学会儿科学分会新生儿学组制订的专家共识11:疑似诊断,即出生3日龄内的新生儿有下列任何一项者:异常临床表现、母亲有绒毛膜羊膜炎、早产胎膜早破大于18 h。如无异常临床表现,血培养阴性,间隔2 4h的连续2 次血非特异性检查2 项以下阳性,则可排除败血症。有异常临床表现,同时满足下列条件中任何一项:有2 项以上的血液非特异性检查阳性;脑脊液检查为化脓性脑膜炎改变;血中检出致病菌DNA。确定诊断为有临床表现,血培养或脑脊液(或其他无菌腔液)培养阳性。新生儿晚发型败血症临床诊断和确定诊断发生
18、在3日龄以上的新生儿,其余条件同新生儿早发型败血症。排除标准:近7 d内使用影响造血功能及免疫功能的药物;确诊为白血病等血液系统疾病者;产妇患有其他基础疾病者;产妇为少数民族者;产妇有吸烟嗜酒史者。选取同期收治的12 9例新生儿科非败血症患者作为对照组。本研究获得我院医学伦理委员会批准实施(编号:2 0 2 0-0 8 9-0 1)。所有患儿家长都知情并自愿签署书面知情同意书。1.2细胞因子的检测方法1.2.1仪器与试剂人淋巴细胞分离液(批号:KLSH2001,规格:100mL),佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)+Ionomycin(离子霉素)淋
19、巴细胞刺激物批号:PI-2014,规格:50(test,T)和RPMI-1640培养基(批号:RPMI12003,规格:50 0 mL)购自深圳市达科为生物工程有限公司。PEanti-humanFOXP3(批号:B279946,规格:10 0 T),FOXP3Fix/PermBufferSet(批号:B335925,规格:10 0 T),PerCP/Cyanine5.5anti-humanIL-17A(批号:B327457,规格:10 0 T),PEMouse IgGl,k Isotype Ctrl(ICFC)(批号:B338362,22在线投稿网址http:/规格:2 5T),PerCP/C
20、yanine5.5 Mouse IgGl,k Iso-type Ctrl(批号:B286218,规格:2 5T),Monensin So-lution(10 0 0 X,批号:B323668,规格:1mL)和BDFACSCantoI 流式细胞仪购自美国BioLegend公司。IL-6、I L-17 试剂盒(批号:2 10 90 2,规格:10 0 T)购自青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司。1.2.2标本采集和制备采集观察组治疗前后和对照组(未接受治疗前)患儿清晨空腹外周静脉血1.5mL,血液样本经EDTA抗凝后于4冷藏。密度梯度离心在2 h内以2000rpm的速度进行2 0 min分离血清,一7
21、0 下保存,用于随后的细胞因子检测。将外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)悬液浓度调整为110 6 8/mL,充分混匀后接种到添加RPMI1640培养液的2 4孔细胞培养板上。培养板上所有孔细胞再分别加人PMA(A b c a m,50 n g/m L)、离子霉素(Abcam,2g/mL)5L、莫能菌素(Monen-sinsolution,M S)5L后混匀,并置于温箱(37,5%COz条件下)避光孵育5h。1.2.3细胞因子IL-6、I L-17 的检测流程样本管中加入2 5L实验缓冲液,再加人2 5L样品血浆后,向所有管中加入2
22、5uL捕获微球抗体(微球加人前充分混匀)和2 5L检测抗体,室温避光震荡孵育2 h(40 0 50 0 r/m in),向所有管中加人2 5LSA-PE,室温避光震荡孵育0.5h(40 0 500r/min),向每管中加人10 0 0 L1洗涤缓冲液,涡旋数秒,40 0 g离心5min,缓慢倒出液体,倒扣于吸水纸上;向每管中加2 0 0 L洗涤缓冲液,涡旋10 s将微球重悬,立即上机检测。样本检测完毕后,保存数据源文件至定义的文件夹内,用分析软件LEG-ENDplex8.0分析同批号标准曲线和标本数据后自动计算输出检测结果(包括IL-6、IL-17 等)。1.2.4Th17、T r e g 细
23、胞的检测流程按1份细胞核固定液配3份磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer solution,PBS)配制细胞核固定液,按1份细胞核破膜液(FOXP3permea-bilizationbuffer,FO X P3Pe r m Bu f f e r)配9份PBS配制FOXP3PermBuffer工作液。收获培养板培养的PBMC于流式管中,离心后去上清,用50 0 LPBS重悬混匀,向所有管加人50 0 L配制的细胞核固定液,室温下避光震荡孵育0.5h(102 0 r/mi n),离心后弃上清,向所有管加人1mL配制的FOXP3Perm-Buffer混匀,30 0 0 rpm,5m i
24、n 离心后去上清,洗涤2次,留30 0 L液体混匀。其中正常对照管加30 0 LPBS混匀后平均分成两管(一管作为正常对照管,一管作为同型对照管)。正常对照管和样本管中均加人5L异硫氰酸荧光素(fluoresceine isothiocya-nate,FITC)抗人 CD4 FITC(a n t i-h u m a n CD 4)、5lPerCP/Cyanine5.5(复合染料)anti-humanIL-17A、5L藻红蛋白(P-phycoerythrin,PE)a n t i-h u-manFOXP3后混匀;同型对照管分别加入5LFITCanti-humanCD4,5L PerCP/Cyan
25、ine5.5 Mouse IgG1,kIsotypeCtrl(同型对照一流式抗体)、5LPEMouse IgGl,k Is o t y p e Ct r l(ICFC)(同型对照一流式抗体)后混匀,所有管室温下避光震荡孵育1.5h(102 0 r/m in)。再向所有管加人1mL配制的FOXP3PermBuffer,30 0 0 r p m,5m i n 离心后去上清,用PBS重悬并通过流式细胞术检测。1.3统计学方法使用SPSS24.0软件完成数据分析,用Graph-padPrism8完成绘图。计数资料采用例数(n)和百分比(%)表示,率的比较采用检验或Fisher确切概率法。计量资料采用均
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