31份小麦材料中抗旱基因的KASP检测.pdf
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1、麦类作物学报2 0 2 3,43(10):12 4112 47Journal of Triticeae Crops网络出版时间:2 0 2 3-0 7-13网络出版地址:https:/ 50 10 0;2.山东农业工程学院农业科技学院,山东德州2 5110 0)摘要:为明确小麦材料中抗旱相关基因的组成,利用已报道的2 9个标记(11个新转化的KASP标记以及已报道的18 个KASP标记),对16 份抗早小麦品种和15份高产小麦品种进行KASP检测。结果表明,多数基因位点在抗旱小麦品种和高产小麦品种间的优异等位基因数目无明显差别;TaPYL1-1B、W c o r 14-2 B、TaSRL1-4
2、A、T a Sn RK 2.3-1A、Q T D W.c a a s-6 BL位点的优异等位基因在旱地品种中占比较高,而TaWRKY51-2B和TaSnRK2.4-3A位点的优异等位基因仅存在于抗旱品种中,前者的供体材料为晋麦47、晋麦92 和晋麦101,后者的供体材料为济麦37 9。关键词:小麦;抗旱;分子标记;育种亲本中图分类号:S512.1;S330文献标识码:A文章编号:10 0 9-10 41(2 0 2 3)10-12 41-0 7Analysis of Drought Resistant Genes in31 Wheat Breeding Materials by KASP Ma
3、rkerLI Wei,KONG Shuxin,SONG Guoqi,LI Yulian,ZHANG Shujuan,ZHANG Rongzhi,GAO Jie,LI Jihu,FAN Qingqi,LI Genying(1.Crop Research Institute,Shandong Academy of Agricultural Sciences/National Engineering Research Center of Wheat andMaize/Key Laboratory of Wheat Biology and Genetics and Breeding in Northe
4、rn Huang-huai River Plain,Ministry of Agricultureand Rural Affairs/Shandong Technology Innovation Center of Wheat,Jinan,Shandong 250100,China;2.College ofAgricultural Science and Technology,Shandong Agriculture and Engineering University,Dezhou,Shandong 251l00,China)Abstract:To clarify drought resis
5、tant alleles in wheat materials,16 drought resistant wheat cultivarsand 15 high-yield wheat cultivars were detected by 29 KASP markers(11 newly converted KASPmarkers and 18 reported KASP markers)related to drought resistance.The result showed that therewas no significant difference in the number of
6、prior elleles between drought resistant cultivars andhigh-yield cultivars for most of the gene loci.The percentage of prior alleles of TaPYL1-1B,Wcorl4-2B,TaSRL1-4A,TaSnRK2.3-1Aand QTDW.caas-6BLloci were higher in drought resistant cultivarsthan in high-yield cultivars.The prior alleles of Ta WRKY51
7、-2B and TaSnRK2.4-3A loci were onlydetected in drought resistant cultivars,and the former donor materials were Jinmai 47,Jinmai 92 andJinmai 10l,and the latter donor material was Jimai 379.Keywords:Wheat;Drought resistance;Molecular marker;Parental materials收稿日期:2 0 2 2-0 6-2 3基金项目:山东省农业科学院农业科技创新工程项
8、目(CXGC2022A01);山东省良种工程项目(2 0 2 1LZGC009)第一作者E-mail:通讯作者:李玮(E-mail:);李根英(E-mail:)修回日期:2 0 2 2-0 7-141242干旱是影响小麦产量的重要因素之一。选育抗旱节水品种是保障旱地小麦稳产最经济、有效的方法。传统小麦抗旱育种是在种质创新的基础上,通过杂交后代的抗旱鉴定和产量筛选培育抗旱品种,通常采用高产抗旱或抗旱抗旱的组合模式,目前仍是品种选育的主流方法。但传统小麦抗旱育种方法周期较长、育种效率低,因此缩短育种年限、加快育种进程已成为目前小麦新品种选育的客观要求。随着小麦基因组的测序完成,越来越多与小麦抗旱相
9、关的基因被定位和克隆,为小麦抗旱分子标记育种奠定了基础。鞠丽萍等!根据不同抗旱性小麦品种中铁结合蛋白基因(TaFer-AI)的序列差异开发了分子标记FerAl-intrl,并进行了有效性验证,发现该标记FerA1-intrl可用于小麦抗旱性的鉴定和筛选,也表明TaFer-A1基因与小麦抗旱性有关。Shoaib等2 利用16 个小麦抗旱基因的KASP标记对153份小麦品种进行了检测,发现优异等位基因与产量性状显著相关。于铭等3 通过分析吡咯啉-5-羧酸合成酶基因(TaP5CS)在不同抗旱性小麦品种中的序列差异,发现第5内含子上存在SNP,据此开发了分子标记TaP5CS-1A-CAPS可用于小麦萌
10、发期抗旱性的筛选与鉴定。Mao等4研究发现,TaPYL1-1B基因启动子区的2 0 bp插人与抗旱性显著关联,2 0bp的插人中含有的MYB元件可以增强Ta-PYL1-1B的表达,从而提高小麦的抗旱性。以上研究均为小麦抗旱品种选育提供了有效标记。随着大量与抗旱相关分子标记的开发与应用,分子标记在抗旱小麦品种辅助选育过程中已成为重要的筛选方法。为提高抗旱小麦育种过程中亲本材料选择的目的性和准确性,本研究利用2 9 个KASP标记,对收集到的16 份抗旱小麦品种和15份高产小麦品种进行检测,明确这些材料中抗旱基因的分布情况,以期为分子标记辅助选择创制聚合优异基因的新种质提供依据。1材料与方法1.1
11、材料供试小麦品种共31份,其中抗旱小麦品种16份,包括济麦37 9、山农2 7、和尚头、青麦6 号、麦类作物学报临麦9号、济麦2 6 2、济麦6 0、存麦1号、晋麦47、晋麦92、晋麦10 1、青麦7 号、鲁麦2 1、品育8 16 1、鹤麦8 0 1和洛旱7 号;高产小麦品种15份,包括MFW1、鲁研12 8、周麦2 7、山农2 0、烟农19、烟农999、中麦57 8、济麦5198、济麦38、山农30、济麦22、山农2 9、百农2 0 7、鲁原50 2 和矮抗58,均由本课题组收集保存。1.2DNA提取和分子标记检测取5粒均匀饱满的小麦种子置于一次性培养皿中,加水浸泡2 4 h左右,待种子露白
12、后选择生长一致的3粒种子种植在装有育苗基质的塑料盆中,在人工气候室(2 3光照/18 黑暗,16 h光照/18 h黑暗)继续培养7 d后,每株取3个叶片,按照高洁等L5的方法提取DNA。1.3分子标记类型转换及KASP检测利用已报道的2 9个标记2-4.6-12 1(表1)对供试材料进行检测,其中18 个标记类型为KASP,所用引物序列参考相应文献。对其他11个标记进行KASP转换,利用文献中报道的原始标记引物序列,通过WheatOmics131网站进行序列比对,获得参考基因组的分子标记扩增序列,按照文献描述的 SNP或Indel信息修改参考基因组序列,获得等位变异序列。用DNAMAN对2 个
13、序列进行比对,设计KASP标记引物。进一步对KASP标记引物进行检测,选取分型效果好的引物组合进行检测。试验所需的KSAP标记引物均由北京擎科生物科技有限公司合成,共有三组混合引物,每一组混合引物都含有两条末端碱基不同的等位基因正向引物(10 0 molL-1)各12 L、一条共同的反向引物(10 0 molL-1)30 L 以及 ddHzO 46 L。PCR反应体系为5L,包括2.0 L DNA(50 n g L-1),2.5L KASP Master Mix(LG C G e n o m ic s,H o d-deston,U K),0.0 7 L混合引物和0.43LddH,O。为避免对试
14、验结果的误判,设置空白对照,其DNA模板用ddHzO代替。PCR反应在ABIveriti PCR仪上进行,PCR反应程序:95预变性15min;95变性2 0 s65退火和延伸2 5s,10个循环;57 退火和延伸6 0 s,30个循环。反应结束后利用PHERA star多功能酶标仪读取荧光数据,通过Kluster Caller软件(LGC Genomics,Hoddeston,U K)生成基因分型图。第43卷第10 期标记名称Marker nameAS-F+AS-RB-Hpal1R+B-Hpal1FInDel-442_genotyping1fehw3TaDreb_SNPTaMoc-2433T
15、aLTPs-KASP-12TaLTPs-KASP-11TaPARG-2A-KASP-9TaPPH-KASP-13TaSAP-7B-KASP-8TaSnRK2.3-1A-KASP-2TaSnRK2.3-1B-KASP-4SnRK2.4A3SnRK2.4B3基因名称一列右上角为引用的参考文献序号。Upper right corner of the gene name column is the serial number of the cited reference.2结果与分析2.1分子标记类型的转换结果由于部分基因(表2 第1列)的原始标记为STS或CAPS,为了提高检测效率,需将其转化成KA
16、SP标记。利用中国春参考基因组通过引物的序列比对,获得引物的物理位置以及11个分子标记扩增产物的原始参考基因组序列,根据SNP或Indel位点设计11对KASP引物,并对31份小麦品种的DNA进行检测,表明这些STS或CAPS标记已成功转化为KASP标记(表2)。其中,TaSRL1-4A基因的2 个SNP转化为2 个KASP标记。2.2KASP标记检测结果利用2 9 个KASP标记对31份小麦品种进行检测,部分标记的检测结果如图1所示。根据31份小麦品种的检测结果,可将KASP标记分成四类,第一类是优异等位基因占比较高的标记(图2),包括DRO5A(90.32%)、T a D r e b _S
17、NP(7 7.42%)、TaPPH-KASP-13(83.87%)、PYL1B(8 3.8 7%)、VSR1-2BMITE(87.10%)、1fe h w 3(7 4.19%)、SnRK2.4B3(90.32%)、T a Sn RK 2.8-5A-K A SP-7李玮等:31份小麦材料中抗旱基因的KASP检测表1已报道的2 9个标记的类型Table 1 Types of 29 markers reported基因名称标记类型标记名称Gene nameMarker typeTaWRKY51-2A6CAPSTaWRKY51-2BL61CAPSTaPYL1-1BL4JSTS1-feh-w32KASP
18、TaDreb-B12KASPTaMocl-A12KASPTaLTPs2KASPTaLTPs2KASPTaPARG-2AL2JKASPTaPPH-7A2KASPTaSAP-7BL2JKASPTaSnRK2.3-1A2KASPTaSnRK2.3-1BL27KASPTaSnRK2.4-3A2KASPTaSnRK2.4-3B2KASP1243基因名称标记类型MarkernameGene nameTaSnRK2.8-5A-KASP-7TaSnRK2.8-5A21TaSnRK2.9-5A-KASP-5TaSnRK2.9-5AL21TaSnRK2.9-5A-KASP-6TaSnRK2.9-5AC2JMITE
19、-F+MITE-RTaVSR1-BE7QTDW.caas-6BL8AX109558906-6BQRDW.caas-6BLLsQSDW.caas-6BLI8AX-95025477-7BQROSA,caas-7BL8TaSRL1-4AC9TaSRL1-4A-dCAPsTaSRL1-4AC95BF+5BRTaCOBL-5BL1014AF+14ARWcor14-2BL10TaOSCA1.4-1B-CAPSTaOSCA1.4-1BL11TaP5CS-1A-CAPSTaP5CS-1A3DRO5ATaDRO-5ALC12TaDRO-5B-InDelTaDRO-5BL12(93.55%)、T a LT Ps-
20、K A SP-11+T a LT Ps-K A SP-12(8 7.10%)和Wcor142B(7 7.42%),表明这些标记检测到的优异等位基因在供试材料中利用程度较高;第二类是两种等位基因占比相当的标记,包括P5CS1A(54.84%)、SRL14A 92 9(54.8 4%)、SRL14A96(54.84%)和 TaSnRK2.3-1A-KASP-2(41.94%),表明这些标记检测到的优异等位基因在供试材料中利用程度中等;第三类是优异等位基因占比较低的标记,包括WRKY51-2B(9.68%)、WRKY51-2A(32.26%)、T a Sn RK 2.3-1B-K A SP-4(22
21、.58%)、Sn RK 2.4A 3(3.2 3%)、T a Sn RK 2.9-5A-KASP-5(23.33%)、T a Sn RK 2.9-5A-K A SP-6(23.33%)、C O BL5B(2 2.58%)、A X10 9 558 9 0 6-6B(29.03%)和OSCA1.4(12.90%),表明这些标记检测到的优异等位基因在供试材料中利用程度较低;第四类是在所检测材料中只检测到一种等位基因的标记,包括TaSAP-7B-KASP-8、A X-95025477-7B、T a M o c-2 433、D RO 5B和TaPARG-2A-KASP-9,其中AX-95025477-7
22、B和TaMoc-2433检测到的基因为非优异等位基因,其余为优异等位基因的功能标记。Marker typeKASPKASPKASPCAPSKASPKASPCAPSCAPSSTSSTSCAPSCAPSKASPSTS1244基因GeneTaCOBL-5BWcor14-2BTaDRO-5BTaOSCA 1.4-1BTaOSCA1.4-1B-CAPSTaP5CS-1ATaP5CS-1A-CAPSTaPYL1-1B InDel-442_genotypingTaSRL1-4ATaSRL1-4ATaVSR1-BMITE-F+MITE-RTaWRKY51-2B B-Hpal1R+B-Hpal1FTaWRKY5
23、1-2A引物名称中的F表示Fam接头,H表示Hex接头,C表示共用引物。In the primer names,F stands for Fam tail;H stands for Hex tail;C stands for common primer.麦类作物学报表2 转化为KASP类型的标记及其引物信息Table 2KASP marker validated and their primer information原始标记KASP标记KASP引物名称Original markerKASPmarker KASP primer name5BF+5BRCOBL5B14AF+14ARWcor142
24、BTaDRO-5B-InDelDRO5BOSCA1.4P5CS1APYL1BSRL14A929TaSRL1-4A-dCAPsSRL14A96VSR1-2BMITEWRKY51-2BAS-F+AS-RWRKY51-2A第43卷KASP引物序列(5-3)KASPprimersequence(5-3)GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCACACGCCATCT-COBL5BFTTCATTTACTAGTAAGAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCACACGCCATCT-COBL5BHTTCATTTACTAGTATCOBL5BCATACAGTACATATTTAATGATTGCAGTAGGG
25、TGAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCCTTCGTCACGC-Wcor142BFTGTCCGGAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGCCTTCGTCACG-Wcor142BHCTGTCCAWcor142BCCTTACGTATGCTGACTGTTTGTTGATTCATTGGAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATGCCAGATGAA-DRO5BFGCATGTATAAGCTAGDRO5BHGAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATGCCAGATGAA-GCATGTATAAGCTACDRO5BCGCGATTTGAAGGGGGTGGCGGAAGGTGACCAAGTTCATG
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