3个蜈蚣科物种线粒体基因组测序及唇足纲的系统发育分析.pdf
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1、3 个蜈蚣科物种线粒体基因组测序及唇足纲的系统发育分析潘阳洋1,陈天韵2,尤春雪1,蒋超2(1.天津农学院 动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室,天津 300384;2.中国中医科学院 中药资源中心 道地药材品质保障与资源持续利用全国重点实验室,北京 100700)摘要:为了探究筛孔蜈蚣属、卫蜈蚣属和蜈蚣属的线粒体基因组序列特征,了解蜈蚣亚科和耳孔蜈蚣亚科在蜈蚣目中的系统发育关系,通过高通量测序技术、序列组装和基因组注释,新获得蜈蚣目蜈蚣科 3 个物种卫蜈蚣属长足卫蜈蚣(Rhysida longipes(Newport,1845)、筛孔蜈蚣属筛孔蜈蚣 sp.1(Eth
2、mostigmus sp.1)和蜈蚣属日本蜈蚣(Scolopendra japonica L.Koch,1878)的全长线粒体基因组序列,其长度分别为 14 992、15 002 和 14 425 bp.通过线粒体基因组注释和分析发现,长足卫蜈蚣、筛孔蜈蚣 sp.1 和日本蜈蚣线粒体基因组 13 个蛋白质编码基因(PCG)的排列顺序均为 COX1-COX2-ATP8-ATP6-COX3-NAD3-NAD5-NAD4-NAD4L-NAD6-COB-NAD1-rrnL-rrnS-NAD2,但筛孔蜈蚣 sp.1 线粒体基因组中 NAD5、NAD4、NAD4L、NAD1、rrnL、rrnS 的转录方向
3、与其他序列相反.基于 13 个PCGs 联合的 14 个唇足纲物种的系统发育树显示,长足卫蜈蚣与筛孔蜈蚣 sp.1 的关系紧密,与日本蜈蚣的关系则较远,地蜈蚣目(Geophilomorpha)和蜈蚣目(Scolopendromorpha)互为姊妹群.关键词:长足卫蜈蚣;筛孔蜈蚣 sp.1;日本蜈蚣;线粒体基因组;唇足纲;系统发育分析中图分类号:Q959.1,S853.72文献标志码:A文章编号:1671-1114(2023)05-0001-07Mitochondrial genome sequencing of three species from Scolopendridaeand phyl
4、ogenetic analysis of ChilopodaPAN Yangyang1,CHEN Tianyun2,YOU Chunxue1,JIANG Chao2(1.Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry,College of Animal Science and Veterinary Medicine,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin 300384,China;2.StateKeyLaboratoryforQualityEnsuran
5、ceand SustainableUseofDaodi Herbs,National Resource Center for Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China)Abstract:In order to explore the mitochondrial genome sequence characteristics of the genera Rhysida,Ethmostigmus andScolopendra,andtoclarifythephyloge
6、neticrelationshipbetweenScolopendrinaeandOtostigminae,thefull-lengthmitochondri-algenomesequence of three species,i.e.Rhysidalongipes(Newport,1845),Ethmostigmus sp.1 and ScolopendrajaponicaL.Koch,1878 was obtained using the methods of High-throughput sequencing techniques,assembly and genome annotat
7、ion.Thelengthofthethreecompletemitochondrialgenomewas14992,15002and14425bp,respectively.Through the annotation andanalysis of the mitochondrial genome,the order of the 13 protein-coding genes was found to be COX1-COX2-ATP8-ATP6-COX3-NAD3-NAD5-NAD4-NAD4L-NAD6-COB-NAD1-rrnL-rrnS-NAD2 in R.longipes,Eth
8、mostigmus sp.1 and S.japonica,but the direction of 6 protein-coding genes(NAD5,NAD4,NAD4L,NAD1,rrnL,rrnS)wasoppsite in Ethmostigmus sp.1.Besides,the phylogenetic relationships of 14 species within Chilopoda were established based on 13 protein coding genes frommitochondrial genomes.The result showed
9、 that R.longipes had a close relationship with Ethmostigmus sp.1,and the relation-shipwithS.japonicawasfaraway.GeophilomorphaandScolopendromorphaweresistergroups.Keywords:Rhysida longipes;Ethmostigmus sp.1;Scolopendra japonica;mitochondrial genome;chilopoda;phylogeneticanalysis收稿日期:2022-11-28基金项目:国家
10、自然科学基金资助项目(83073972);中央本级重大增减支项目“名贵中药资源可持续利用能力建设项目”(2060302).第一作者:潘阳洋(1999),女,硕士研究生.通信作者:尤春雪(1987),女,讲师,主要从事中药仓储害虫防治、中药活性成分等方面的研究.E-mail:.蒋超(1988),男,副研究员,主要从事中药分子鉴定方面的研究.E-mail:.第 43 卷第 5 期2023 年 9 月天 津 师 范 大 学 学 报(自 然 科 学 版)Journal of Tianjin Normal University(Natural Science Edition)Vol.43 No.5Sep
11、.2023doi:10.19638/j.issn1671-1114.20230501天 津 师 范 大 学 学 报(自 然 科 学 版)2023 年 9 月蜈蚣是唇足纲蜈蚣目动物的统称,目前已记录 5科 27 属.作为节肢动物进化的重要环节,蜈蚣的遗传分类对物种进化研究具有重要意义.目前已有许多基于单基因序列或多基因联合分析蜈蚣进化、系统发育和分类鉴定的报道,尤其是基于 DNA 分子系统发育的研究1.随着二代 DNA 测序技术的快速发展,越来越多的学者使用线粒体基因组(mitochondrial genome)研究物种分类、生物体的遗传发育和生物系统发育2.区别于核基因,线粒体基因组是母系遗传
12、,其结构简单,易于分析3.线粒体基因组通常是 1 个环状双链DNA 分子,包括 13 个蛋白质编码基因(PCG)、22 个转移 RNA 基因(tRNA)、2 个核糖体 RNA 基因(rRNA)和 1 个控制区(CR)4-5.虽然线粒体基因组的结构相对保守,近年来许多研究却发现,在蜈蚣的线粒体基因组中存在基因重排现象,并且伴随有 tRNA 二级结构的缺失等变化6.目前已公布的唇足纲物种的线粒体基因组序列仅有 14 个,在蜈蚣目物种的线粒体基因组序列中,有 4 个属于蜈蚣属(Scolopendra),1 个属于尖盲蜈蚣属(Scolopocryptops),缺乏科内其他属的数据,因此难以进行跨种属线
13、粒体结构分析.本研究对蜈蚣科的 3 个物种,即卫蜈蚣属长足卫蜈蚣(Rhysida longipes(Newport,1845)、筛孔蜈蚣属筛孔蜈蚣 sp.1(Ethmostigmus sp.1)和蜈蚣属日本蜈蚣(Scolopendra japonica L.Koch,1878)进行全长线粒体基因组测序,分析其线粒体基因组的基因重排模式,并依据 13 个 PCGs 进行唇足纲的系统发育分析,为蜈蚣的形态学分类提供数据支持,并有助于了解蜈蚣目独有的基因重排模式.1材料与方法1.1样品采集和 DNA 提取长足卫蜈蚣(CMMI:20200511008),采集于云南省红河哈尼彝族自治州;筛孔蜈蚣 sp.
14、1(CMMI:20191212012),采集于云南省德宏傣族景颇族自治州盈江县太平镇;日本蜈蚣(CMMI:20190904004),采集于广西壮族自治区来宾市金秀瑶族自治县.样本保存于 70%75%的乙醇中.取每个样本的 3 条足,干燥后研磨成粉末放入2.0 mL 的离心管中,然后使用 Promega WizardRSVGenomic DNA Purification kit 试剂盒(美国 Promega 公司)提取蜈蚣 DNA,DNA 样品储存于-20 益冰箱待用.1.2线粒体基因组的测序和组装用InvitrogenCollibriNGS建立基因组DNA文库,用illuminaHiSeq25
15、00平台,按照 PE150bp规程进行测序,由北京诺禾致源科技股份有限公司完成.每个物种的线粒体基因组数据为5伊1096伊109.用 GetOrganelle7软件进行序列组装,获得线粒体基因组序列.1.3线粒体基因组的注释应用 Mitos28注释 tRNAs、rRNA 及 PCGs 的位置,对于未注释上的 tRNA,应用 Phylosuite 1.2.29软件并利用近缘物种比对的方式进行预测.通过 rtools10网站(http:/rtools.cbrc.jp/cgi-bin/index.cgi)预测 tRNA 的二级结构,NCBI 网站Conser-ved Domains11-14(htt
16、ps:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)验证 13 个 PCGs 的编码区域并进行调整,OGDRAW15网站(https:/chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)绘制线粒体基因组圈图.应用 AT-Skew 和 GC-Skew16评估所有线粒体基因组的链不对称性,应用 CodonW17软件计算密码子偏好性(RSCU).AT-Skew=(A-T)/(A+T)(1)GC-Skew=(G-C)/(G+C)(2)式中:A、T、G、C 均为碱基.1.4系统发育分析为判断线粒体基因组数据与传统的形态学系统发育
17、关系之间的联系,选取 3 种蜈蚣和已公布的唇足纲共 14 个物种(表 1)的全长线粒体基因组序列建立系统发育树,并且选取蚰蜒目的蚰蜒(Scutigera coleo-ptrata(Linnaeus,1758),AJ507061.2)作为外类群.利用CLUSTAL W18在 BIOEDIT 7.1.3.019中比对 13 个PCGs.用 Phylosuite 1.2.29软件分别构建贝叶斯推断法(Bayesian inference,BI)和最大似然法(maximum like-lihood,ML)的系统发育树,并且利用 ModelFinder20功能选择合适的模型,最大似然法的模型为GTR+F
18、+R3,贝叶斯推断法的模型为 GTR+F+I+G4.使用 IQ-TREE 构 建 最 大 似 然 树,采 用 超 快 自 展(ultrafastbootstraping)法重复 100 000 次计算分支置信度;应用Mr-Bayes 构建贝叶斯树,利用 4 条蒙特卡 罗马尔可夫链(Markov Chain Monte Carlo,MCMC)同时运行1000000 代,抽样频率为 1000,摒弃 25%的老化样本.2结果与分析通过高通量测序技术、序列组装和基因组注释,获得长足卫蜈蚣、筛孔蜈蚣 sp.1 和日本蜈蚣的全长线粒体基因组,均为环状 DNA,其序列长度分别为14 992、15 002 和
19、 14 425 bp.由表 1 可以看出,除石蜈蚣目的长角石蜈蚣(Cermatobius longicornis(Takakuwa,1939)线粒体基因组长度为 16 833 bp 外,大部分的2窑窑第 43 卷第 5 期唇足纲物种线粒体基因组长度为 14 00016 000 bp.2.1线粒体基因组结构及组成分析3 种蜈蚣的线粒体基因组均包含 37 个基因,包括 13 个 PCGs、22 个 tRNA 基因和 2 个 rRNA 基因,如图 1 所示.蜈蚣目物种线粒体基因组中,不同 PCGs 的长度差异显著,13 个 PCGs 长度最小的为ATP8,8 个物种的平均值为 158 bp,最大的为
20、 NAD5,平均值为1 622 bp,如图 2 所示.多数 PCGs 在不同蜈蚣物种之间长度存在差异,如日本蜈蚣ATP6长度最大,达696 bp,而筛孔蜈蚣 sp.1 的 ATP6 长度最小,仅 361 bp.同其他PCGs 相比,ATP8的长度最稳定.13 个 PCGs在不同蜈蚣物种间的长度差异分别为:ATP8,12bp;ATP6,335bp;COB,31 bp;COX1,45 bp;COX2,23 bp;COX3,53 bp;NAD1,96 bp;NAD2,169 bp;NAD3,122 bp;NAD4,189bp;NAD4L,81bp;NAD5,527 bp;NAD6,331 bp.蜈蚣
21、目物种的全线粒体基因组的核苷酸组成如图 3 所示.由图 3 可以看出,AT 含量均大于 GC 含量,表现为 AT 富集,各物种的 GC 含量在 21.22%(少棘蜈蚣)32.52%(筛孔蜈蚣 sp.1)之间,其中,筛孔蜈蚣sp.1 的 GC 含量与长足卫蜈蚣(32.27%)的几乎相等.(a)长足卫蜈蚣(b)筛孔蜈蚣 sp.1(c)日本蜈蚣complex 玉(NADH dehydrogenase)complex 芋(ubichinol cytochrome c reductase)complex 郁(cytochrome c oxidase)ATP synthasetransfer RNAsri
22、bosomal RNAsorigin of replicationcomplex 玉(NADH dehydrogenase)complex 芋(ubichinol cytochrome c reductase)complex 郁(cytochrome c oxidase)ATP synthasetransfer RNAsribosomal RNAsorigin of replicationcomplex 玉(NADH dehydrogenase)complex 芋(ubichinol cytochrome c reductase)complex 郁(cytochrome c oxidase)A
23、TP synthasetransfer RNAsribosomal RNAsorigin of replication图 13 种蜈蚣的线粒体基因组圈图Fig.1Mitochondrial genome composition of three species of Scolopendridae表 1本研究中的 3 种蜈蚣和已发布的 11 个唇足纲物种的线粒体基因组数据Tab.1Mitochondrial genome data of the three species inthisstudyandthe other11speciesfromChilopodadata of which hav
24、e been published物种名中文名线粒体基因组全长/bpGenBank 序列号Scutigera coleoptrata蚰蜒14 922AJ507061.2Bothropolys sp.穴石蜈蚣 sp.15 139AY691655.1Cermatobius longicornis长角石蜈蚣16 833KC155628.1Lithobius forficatus剪石蜈蚣15 695AF309492.1Mecistocephalus marmoratus 大理地蜈蚣15 279KX774322.1Scolopendra morsitans赤蜈蚣14 019MW810062.1Scolop
25、endra hainanum海南蜈蚣15 057MZ569035.1Strigamia maritima海滨纹地蜈蚣14 983KP173664.1Scolopendra dehaani哈氏蜈蚣14 538KY947341.1Scolopocryptops sp.尖盲蜈蚣 sp.15 119KC200076.1Scolopendra mutilans少棘蜈蚣15 011MN317390.1Rhysida longipes长足卫蜈蚣14 992OP747462Ethmostigmus sp.1筛孔蜈蚣 sp.115 002ON468508Scolopendra japonica日本蜈蚣14 42
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