1株耐盐耐低温沼泽红假单胞菌的分离筛选及培养基优化.pdf
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1、LUY:NO.20.2023饲料研究FEEDRESEARCH103试验研究1株耐盐耐低温沼泽红假单胞菌的分离筛选及培养基优化鲁晏宏12王蕊王珺胡婷付维来!朱传忠1汪攀2.3*(1.福建大北农华有水产科技集团有限公司福建省水产功能性饲料及养殖环境调控重点实验室,福建漳州363500;2.北京大北农科技集团股份有限公司,北京10 0 0 8 0;3.九江大北农水产科技有限公司,江西九江332 0 0 0)摘要:试验旨在筛得耐盐耐低温可调水的光合细菌并进行扩培培养,为光合细菌的产业化生产及应用提供参考。试验由环境样中分离光合细菌,经耐盐性低温试验及降亚硝能力测试筛菌,采用响应面优化筛得菌株培养基。结
2、果显示,DBNRh06在光照及黑暗条件下培养48 h时对亚硝酸盐降解率均可达6 5%,在盐度为35条件下的OD60mm值可达0.7,在15、12 0 h时对亚硝酸盐的降解率仍可达50%。利用响应面优化法优化DBNRh06得到最佳培养基配方为草酸铵2 g/L、乙酸钠1.5g/L、酵母粉1.5g/L。利用最优培养基配方,在30、10 0 0 2 0 0 0 lx光照培养9 6 h,得到DBNRh06的OD660mm值为0.8 7 7,与预测的最大值0.8 6 0 非常接近。研究表明,筛得1株耐盐度较好且低温仍可降亚硝酸盐的沼泽红假单胞菌,为光合细菌在水产养殖业的实际应用奠定基础。关键词:沼泽红假单
3、胞菌;培养基优化;响应面优化中图分类号:S816文献标识码:A文章编号:10 0 2-2 8 13(2 0 2 3)2 0-0 10 3-0 6Doi:10.13557/ki.issn1002-2813.2023.20.020Isolation,screening and medium optimization ofa salt-tolerant and low-temperature strain of Rhodopseudomonas palustrisTingFU Wei-laiZHU Chuan-zhongWANGPanan-hongWANGRuiWANGJunHU TingFUWRu
4、iWANG JunHU TingFU Wei-laiZHU ChuaAbstract:The aim of the experiment was to screen and expand the cultivation of salt-tolerant and low-temperaturewater-regulating photosynthetic bacteria,and provide reference for the industrial production and application ofphotosynthetic bacteria.Photosynthetic bact
5、eria were isolated from environmental samples,screened by low temperaturetest of salt tolerance and nitrite reduction ability,and screened by response surface optimization.The results showed thatthe nitrite degradation rate of DBNRh06 could reach 65%under both light and dark conditions for 48 h,ODc0
6、 mm couldreach 0.7 under salinity of 35,and the nitrite degradation rate could stil reach 50%at 15 C a n d 12 0 h.T h e o p t i ma lmedium formula of DBNRh06 was ammonium oxalate 2 g/L,sodium acetate 1.5 g/L and yeast powder 1.5 g/L.Using theoptimal medium formula,the OD660 m of DBNRh06 was 0.877,wh
7、ich was very close to the predicted maximum value of0.860,after being cultured at 30 a n d 1 0 0 0 2 0 0 0 1x f o r 9 6 h.T h e s t u d y i n d i c a t e s t h a t a s t r a i n o f Rh o d o p s e u d o mo n a spalustris with good salinity tolerance and low temperature can still reduce nitrite is sc
8、reened,which has a foundation forthe practical application of photosynthetic bacteria in aquaculture industry.Key words:Rhodopseudomonas palustris;medium optimization;response surface method我国水产养殖规模逐渐扩大并日趋集约化,产量提升的同时水体中积存大量的残饵、水生物排泄物等有机物,导致养殖废水污染问题愈加严重-2。同时,集约化第一作者:鲁晏宏,硕士,工程师,研究方向为微生物研究与应用。通信作者:汪攀,博
9、士,高级工程师。基金项目:福建省“百人计划”创新人才项目;九江市“双百双千”项目;中央引导地方科技发展专项“大黄鱼健康养殖及主要病害综合防控技术集成创新与产业化(项目编号:2022L3020047)收稿日期:2 0 2 3-0 4-12养殖、大量投饵造成水体亚硝酸盐含量高,会直接危害水产动物机体健康。养殖废水处理不当会制约我国水产养殖业的发展 3-6 ,因此,高效、便捷、低成本地处理养殖废水是保证水产养殖业可持续发展的关键。光合细菌可降解水体中亚硝酸盐、氨氮、硫化物等,具有调水稳水的作用 7。刘洋等8 研究表明,光合细菌可有效去除污水中的硝酸盐和氨氮。Fan等1研究了光合细菌处理废水至符合国家
10、排放标准的方法。光合细菌菌体本身无毒害、营养丰富,可作为饲料添加剂促进动物生长,将光合细菌拌喂乌,可提升乌的食用口感及营养价值10-1。养殖水产品的多样性、冬棚南美白对虾的养殖及养NO.202023饲料研究FEEDRESEARCH104试验研究殖水温跃层现象等对光合细菌的作用温度提出了进一步要求12-14。我国海洋资源丰富,海水养殖面积日渐扩大,但目前全球7 7%的养殖水产品仍来自淡水养殖,海水与淡水养殖的差异对光合细菌提出了进一步的要求 15。为开发利用光合细菌,需扩增光合细菌以满足工厂实际生产需求。本研究致力于筛选耐盐、耐低温、可调水的光合细菌并扩培,为水产养殖业更好发展及光合细菌在水产养
11、殖业的实际应用提供参考1材料与方法1.1试验材料1.1.1富集培养基 16 初始发酵培养基:蛋白陈0.3g、酵母粉0.5g、NH,Cl1g、Na C I1g、C,H,O,Na 3H,O1 g、二水合丁二酸钠1 g、K H,PO,0.5 g、M g C l,6 H,O 0.5g、C a C l,0.1 g、蒸馏水1L,p H 值7.0。亚硝氮培养基:亚硝酸溶液(2.5g/L)50 L、大北农金贝虾苗宝虾料0.0 5g、蒸馏水50 mL,12 1灭菌2 0 min。1.1.2样品采集与富集样品采集与富集参考王雨婷等117 的试验方法。1.2试验方法1.2.1光合细菌的分离纯化从变色的厌氧管中取1m
12、L,梯度稀释涂布于固体富集培养基,30、10 0 0 2 0 0 0 1x光照厌氧培养3 7 d。挑取红色单菌落,纯化至显微镜下菌体形态一致 7 1.2.2光合细菌菌株的确定1.2.2.1形态学观察观察菌落形态,挑取菌落进行革兰氏染色并在光学显微镜下镜检8 1.2.2.216SrRNA鉴定细菌对的16 SrRNA鉴定参考文献 19 方法进行鉴定台降留试1.2.3亚硝酸盐降解试验1.2.3.1标准曲线制作配制0、0.0 5、0.10、0.2 0、0.40、0.8 0、1.6 0、3.20mg/L的亚硝酸钠样液,吸取不同浓度样液2 0 0 L,依次加入格里斯A、B试剂各2 0 L,测定OD50mm
13、值,制作标准曲线 6 1.2.3.2亚硝态氮测定取50 L菌液接种到50 mL亚硝氮培养基中,分别置于30 C光照与30 C无光照培养箱,取2 4、48 h的样品,12 0 0 0 r/min离心3min取上清液,依次加入格里斯A、B试剂各2 0 L,测量OD550m值,并代入标准曲线计算对应亚硝酸含量,计算亚硝降解率 6 。亚硝降解率=(CK亚硝酸盐含量-处理组亚硝酸盐含量)/CK亚硝酸盐含量10 0%(1)1.2.4耐盐度测试挑取菌株接入初始发酵培养基,30、10 0 0 2 0 0 0 1x光照培养5d作为种子液。采用盐度计调整初始发酵培养基盐度分别为5、15、2 5、35,12 115
14、min高温高压灭菌。以5%接种量分别接入不同盐度的10 0 mL无菌培养基,30、10 0 0 2 0 0 0 1x光照培养5d,测OD60mm值 2 0 。由耐盐度及亚硝酸盐降解率选择菌株DBNRh06进行进一步研究。1.2.5不同温度下DBNRhO06亚硝酸盐降解率取50 L菌液接入50 mL亚硝氮培养基中,分别置入15、2 0、2 5培养箱,取2 4、48、7 2、9 6 h的样品,12000r/min离心3min,取上清液,依次加入格里斯A、B试剂各2 0 L,测量OD550m值,将OD550mm值代入标准曲线计算对应的亚硝酸含量和亚硝降解率 2 1.3单因素试验1.3.1不同碳源对D
15、BNRh06生长特性的影响分别以乙酸钠、葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、苹果酸、碳酸氢钠作为碳源替换初始发酵培养基碳源并以1g/L添加。接种量为2%光照厌氧培养9 6 h测OD660mm值。选择最佳碳源并配制浓度为0.6、0.8、1.0、3.0、5.0、7.0 g/L进行进一步试验1.3.2不同氮源对DBNRhO6生长特性的影响将初始发酵培养基中的氮源以草酸铵、乙酸铵、氯化铵、硫酸铵、硝酸钠、谷氨酸钠、尿素、作为氮源按照1g/L的含量替换添加。接种量为2%光照厌氧培养96h测OD660mm值。选择最佳氮源并配制浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%进行进一步试验。1.3.3不同
16、生长因子对DBNRh06生长特性的影响将初始发酵培养基中的生长因子以蛋白陈、酵母粉、牛肉粉按0.5g/L的含量替代添加,接种量为2%光照厌氧培养9 6 h测OD660nm值。选择最佳生长因子并配制浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L进行进一步试验。1.4Box-benhken优化试验由浓度梯度试验确定响应面试验的中心点及区间,以Design-expertl0.0软件设计方案,优化乙酸钠、草酸铵、酵母粉配比。以菌株生长OD60m值为响应值进行17组Box-benhken试验设计(见表1)。对试验结果进行分析,得到最佳培养基配比并进行验证 2 1。表1Box-benhken
17、试验设计因素与水平单位:g/L水平A草酸铵B乙酸钠C酵母粉-120.51.5031.02.0141.52.51.5数据统计与分析试验数据采用SPSS软件进行统计分析,Duncans方法进行多重比较。结果以“平均值标准差”表示,P0.05表示差异显著2结果与分析2.1光合细菌富集结果富集的32 个样品中3个样品有颜色变化,颜色分另NO.202023饲料研究FEEDRESEARCH105试验研究为棕红色、紫红色及深红色2.2光合细菌的形态学特征(见表2、图1)由表2、图1可知,本试验从北京东升科技园分离纯化得到棕红色的RC3-1菌株,从福建龙海市水样分离纯化得到了紫红色的DBNRh06菌株,从广东
18、佛山水样中分离纯化得到深红色的菌株DBNRh32。表2 光合细茵菌株形态特征菌株编号分离地菌体形态革兰氏染色液体培养菌落形态菌株形态溶血性RC3-1北京短杆状G-棕红色圆形椭球形阴性DBNRh06福建龙海市棒状或短杆状G-紫红色针尖状细杆状阴性DBNRh32广东佛山球状G-深红色圆形圆球形阴性(a)RC3-1菌落特征(b)RC3-1菌株形态(c)DBNRh06菌落特征(d)DBNRh06菌株形态*:(e)DBNRh32菌落特征(f)DBNRh32菌株形态图1菌株形态特征2.316SrRNA鉴定结果对筛得菌株提取基因组DNA进行16 SrRNA基因扩增并测序,获得的菌株序列提交至NCBI数据库进
19、行比对申请基因登录号,结合相似度最高的模式菌株序列构建系统发育树(见图2)。由图2 可知,RC3-1为荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus),D BNRh O 6 为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris),D BNRh 32 为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。99Rhodobacterlacus JA826(LN835251)87-RhodobactermarisJA276T(AM745438)100RhodobacteraestuariDSM19945T(igi.1096509)RC3-1(KF606886.1)
20、68100RhodobactercapsulatusDSM1710(igi.1048965)100DBNRh32(KT180199.1)100 Rhodobacter sphaeroides ATH2.4.1T(CP000143)Rhodobacterflagellatus SYSUG03088(MN174111)93RhodobactertardusCYK-10(MK209068)DBNRh06(KF926677.1)100RhodopseudomonaspalustrisDSM123(AB175650)Ectothiorhodospiravariabilis WN22T(AM943121)
21、0.020图2基于16 S rRNA基因序列构建的系统发育树2.4亚硝酸盐降解率的标准曲线及测定结果2.4.1标准曲线的制作(见图3)由图3可知,亚硝酸盐含量标准曲线拟合方程为y=0.3311x+0.0712,R=0.9998,表明模型拟合度高,可作为标准曲线使用0.60.50.40.30.20.10.250.500.751.001.251.50亚硝酸盐含量/mg/L)图3亚硝酸盐标准曲线2.4.2不同菌株亚硝酸盐降解率(见表3)由表3可知,RC3-1亚硝降解率较差,显著低于其余菌株(P0.05);D BNRh 32 与DBNRh06均具有较好的亚硝降解率,在光照及黑暗情况下培养2 4、48
22、h均可达到6 5%以上。表3不同菌株亚硝酸盐降解率单位:%24h光照48h光照组别24h暗培养48h暗培养培养培养RC3-115.27 5.79c39.36 4.29b2.28 2.28c20.61 2.06bDBNRh3268.65 0.75a68.83 0.76a68.27 1.46a68.49 0.82aDBNRh06 35.88 1.43b67.38 0.28a19.62 1.74b 65.67 1.07a注:同列数据肩标不同字母表示差异显著(P0.05)。2.5菌株在不同盐度下的生长状况(见图4)1.0RC3-1DBNRh06日DBNRh320.80.60.40.25152535盐度
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