BRCA1 R1325K突变对胆囊癌细胞增殖及凋亡的影响.pdf
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1、Vol.43 No.9 Sept.2023上海交通大学学报(医学版)JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)http:/上海交通大学学报(医学版),2023,43(9)BRCA1 R1325K突变对胆囊癌细胞增殖及凋亡的影响杨婧潇1,贾子尧1,吴文广1,吴向嵩2,3,张飞2,3,李怀峰2,3,朱逸荻2,3,李茂岚11.上海交通大学医学院附属仁济医院胆胰外科,上海 200127;2.上海交通大学医学院附属新华医院普外科,上海 200092;3.上海市胆道疾病研究中心,上海 200092摘要 目的探究乳腺癌易感基因1(bre
2、ast cancer susceptibility gene 1,BRCA1)第1325位精氨酸变为赖氨酸(R1325K突变)对胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ增殖和凋亡的影响。方法使用BRCA1野生型过表达慢病毒、BRCA1 R1325K突变过表达慢病毒以及阴性对照慢病毒载体构建胆囊癌细胞系 GBC-SD 和 NOZ 稳转株。细胞分为不含目的基因的对照组、BRCA1野生型组及BRCA1突变组,并通过Western blotting验证目的蛋白BRCA1的表达情况。选用针对BRCA1突变的抑制剂奥拉帕利(Olaparib)20 mol/L处理BRCA1突变组胆囊癌细胞,并根据目的蛋白的表达情况
3、和加药与否将胆囊癌细胞系分为对照组、BRCA1野生型组、BRCA1突变组和BRCA1突变+Olaparib组。通过CCK8实验和克隆形成实验观察BRCA1 R1325K突变对胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ增殖能力及克隆形成能力的影响,通过TUNEL实验观察BRCA1 R1325K突变对胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ凋亡情况的影响,并通过Western blotting检测凋亡相关蛋白cleaved PARP、Bcl-2和Bax的表达情况。使用抑制剂Olaparib处理BRCA1 R1325K突变过表达胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ,并检测BRCA1 R1325K突变引起的相应表型改变(促
4、进增殖、增强克隆形成能力和抑制凋亡)是否能被抑制剂所逆转。结果通过CCK8实验和克隆形成实验发现:相较于对照组及BRCA1野生型组,BRCA1 R1325K突变能够促进胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ的增殖,并提高其克隆形成能力;抑制剂Olaparib处理则能够抑制BRCA1突变胆囊癌细胞系的增殖(均P0.05)。通过TUNEL和Western blotting 实验发现:相较于对照组,野生型 BRCA1 基因过表达能够诱导胆囊癌细胞系 GBC-SD 和 NOZ 的凋亡;BRCA1突变组相较于对照组和BRCA1野生型组,有抵抗凋亡的作用,且升高了凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达并降低了促凋亡蛋白B
5、ax的表达(P0.05)。结论BRCA1 R1325K突变能够促进胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ的增殖并抑制其凋亡。关键词胆囊癌;BRCA1;突变;增殖;凋亡DOI10.3969/j.issn.1674-8115.2023.09.001 中图分类号R735.8 文献标志码AEffect of BRCA1 R1325K mutation on proliferation and apoptosis of gallbladder cancer cellsYANG Jingxiao1,JIA Ziyao1,WU Wenguang1,WU Xiangsong2,3,ZHANG Fei2,3,LI H
6、uaifeng2,3,ZHU Yidi2,3,LI Maolan11.Department of Biliary-Pancreatic Surgery,Renji Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200127,China;2.Department of General Surgery,Xinhua Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200092,China;3.Shanghai Key Labo
7、ratory of Biliary Tract Disease Research,Shanghai 200092,ChinaAbstract Objective To investigate the effects of breast cancer susceptibility gene 1(BRCA1)R1325K mutation arginine(R)to lysine(K)mutation at amino acid 1325 on the proliferation and apoptosis of gallbladder cancer cell lines GBC-SD and N
8、OZ.Methods BRCA1 wild-type overexpression lentivirus,BRCA1 R1325K mutation overexpression lentivirus,and negative control lentivirus were used to construct the stable transgenic strains of gallbladder carcinoma,cell lines GBC-SD and NOZ.The cells were divided into the control group without the targe
9、t gene,the BRCA1 wild-type group,and the BRCA1 R1325K mutation group.The expression of target protein was verified by Western blotting.The BRCA1 R1325K mutant gallbladder cancer cells were treated with 论著 基础研究基金项目 国家重点研发计划(2021YFE0203300);国家自然科学基金面上项目(82073206);上海市卫生健康委员会健康产业临床研究专项(20224Z0014);上海市教育
10、委员会曙光项目(20SG14);上海市科学技术委员会基础研究项目(20JC1419100,20JC1419101,20JC1419102);上海市申康医院发展中心临床科技创新项目(SHDC12019110);上海市消化疾病临床医学研究中心分中心(19MC1910200);上海交通大学医学院“双百人”项目(20181808)。作者简介 杨婧潇(1998),女,硕士生;电子信箱:yang_。通信作者 李茂岚,电子信箱:。Funding Information National Key Research and Development Program of China(2021YFE0203300)
11、;National Natural Science Foundation of China(82073206);Shanghai Municipal Health Commission Health Industry Clinical Research Special Project(20224Z0014);Shuguang Program of Shanghai Education Development Foundation and Shanghai Municipal Education Commission(20SG14);Basic Research Project of Scien
12、ce and Technology Commission of Shanghai Municipality(20JC1419100,20JC1419101,20JC1419102);Clinical Science and Technology Innovation Project of Shanghai Shenkang Hospital Development Center(SHDC12019110);Shanghai Clinical Medical Research Center for Digestive Diseases(19MC1910200);“Two-hundred Tale
13、nts”Program of Shanghai Jiao Tong University School of Medicine(20181808).Corresponding Author Li Maolan,E-mail:.10712023,43(9)上海交通大学学报(医学版)Vol.43 No.9 Sept.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)20 mol/L Olaparib,a BRCA1 mutation inhibitor.Gallbladder cancer cell lines were di
14、vided into the control group,the BRCA1 wild-type group,the BRCA1 R1325K mutation group,and the BRCA1 R1325K mutation+Olaparib group according to the target gene expression and whether or not the inhibitor was added.The effect of BRCA1 R1325K mutation on proliferation and clonogenesis ability of gall
15、bladder cancer cell lines GBC-SD and NOZ was observed by CCK8 assay and clonogenesis assay,respectively.The effect of BRCA1 R1325K mutation on apoptosis of gallbladder cancer cell lines GBC-SD and NOZ was observed by TUNEL assay.The expressions of apoptosis-related proteins,cleaved PARP,Bcl-2 and Ba
16、x,were detected by Western blotting.The inhibitor Olaparib was used to treat the BRCA1 R1325K mutant gallbladder cancer cell lines GBC-SD and NOZ.The phenotypic changes(promoting proliferation,enhancing clonogenesis and inhibiting apoptosis)induced by BRCA1 R1325K mutation were tested in the presenc
17、e of Olaparib to determine whether the changes could be reversed by the inhibitor.Results The results of CCK8 assay and clonogenesis assay showed that BRCA1 R1325K mutation could promote the proliferation of gallbladder cancer cell lines GBC-SD and NOZ,and improve their clonal formation ability,comp
18、ared with the control group and the BRCA1 wild-type group.Olaparib inhibited the proliferation of gallbladder cancer cell lines overexpressing BRCA1 R1325K mutation(P0.05).Through TUNEL and Western blotting,it was found that overexpression of wild-type BRCA1 could induce the apoptosis of gallbladder
19、 cancer cell lines GBC-SD and NOZ,compared with the control group.Compared with the control group and the BRCA1 wild-type group,the BRCA1 R1325K mutation group had anti-apoptotic effect,in which the expression of apoptosis-inhibiting protein Bcl-2 increased and the expression of pro-apoptotic protei
20、n Bax decreased(P0.05).Conclusion BRCA1 R1325K mutation can promote the proliferation of GBC-SD and NOZ cell lines and inhibit their apoptosis.Key words gallbladder cancer;BRCA1;mutation;proliferation;apoptosis胆囊癌是一种常见的胆道恶性肿瘤,现已成为全球消化道肿瘤发病率排名第五的恶性肿瘤1。我国属胆囊癌高发地区,且近年来发病率持续上升2-3。由于胆囊癌发病隐匿,早期无特异性临床表现,但侵
21、袭性强,进展迅速,诊断时往往已达晚期,手术切除率低,术后易出现复发和远处转移,预后较差,5年生存率仅 5%15%4-6。根据国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)2020年全球癌症数据库7,每年胆囊癌新发病例占所有肿瘤的0.6%,死亡病例则占所有癌症死亡人口的0.9%。因此,推进对胆囊癌的相关研究,寻找新的胆囊癌标志物和治疗靶点,对于提高胆囊癌诊疗水平显得愈发重要。BRCA(breast cancer susceptibility gene)基因家族在 DNA 损伤修复中发挥着重要作用。其中,BRCA1参与激活双链断
22、裂修复和同源重组,还可通过调控转录及细胞周期来影响 DNA 损伤修复过程8。BRCA1突变分为生殖系突变(体内所有细胞均存在突变)和体细胞突变(仅在肿瘤细胞中检测到BRCA1突变)。目前已有许多研究表明,BRCA基因家族生殖系突变与前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等许多肿瘤的发生和发展密切相关9-11。其中BRCA1生殖系突变是已知的最有可能导致女性家族性乳腺癌和卵巢癌的遗传因素,且与不良预后相关12-14。BRCA1的体细胞突变发生率低于生殖系突变。也有研究15-16表明在卵巢癌等肿瘤中,体细胞突变患者发病年龄更晚,但在治疗敏感性和无进展生存时间上与生殖系突变患者无明显差异。还有的研究17-
23、18发现,在其他一些肿瘤,BRCA1突变有促进增殖与抑制凋亡的作用。对于BRCA1突变的肿瘤,存在同源重组修复异常,而使用聚 ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)抑制剂能够抑制DNA损伤修复过程,造成DNA双链断裂,继而引起修复混乱,通过“合成致死”效应达到促进肿瘤细胞凋亡的目的19-20。在此前的临床工作里,我们收治了 1 例BRCA1 R1325K(第1325位精氨酸变为赖氨酸)生殖系突变胆囊癌患者;该患者使用PARP抑制剂奥拉帕利(Olaparib)后肿瘤缩小降期,达到R0切除,成功实现了转化治疗。目前,在胆囊癌中,尚无BRCA1 R132
24、5K突变及其作用的相关报道。基于上述基础,本研究拟进一步探索BRCA1及其R1325K突变对于胆囊癌细胞增殖及凋亡的影响。1材料与方法1.1主要实验材料及仪器胆囊癌细胞系 GBC-SD和 NOZ均为本实验室保存。使用GV705载体构建添加Flag标签及嘌呤霉素抗性基因但不含有目的基因的对照过表达慢病毒载体(Vector)、BRCA1 野 生 型 过 表 达 慢 病 毒 载 体 及BRCA1 R1325K突变过表达慢病毒载体,并包装慢病毒(由上海吉凯生物科技有限公司完成)。抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、微管1072杨婧潇,等BRCA1 R1325K突变对胆囊癌细胞增殖及凋亡的影响h
25、ttp:/上海交通大学学报(医学版),2023,43(9)蛋白(-tubulin)抗体、Flag抗体、cleaved PARP抗体、Bcl-2 抗 体、Bax 抗 体(美 国 Cell Signaling Technology公司),BRCA1抗体(武汉三鹰生物技术有限公司),CCK8试剂盒(翊圣生物科技上海有限公司),一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(绿色荧光)、苯甲基磺酰氟(PMSF)(上海碧云天生物技术有限公司),Olaparib(美国MedChemExpress公司),中强度RIPA裂解液、5上样缓冲液(上海雅酶生物科技有限公司)。光学倒置显微镜(日本Nikon公司);Leica倒置
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