DB44∕T 2340.4-2021 诸氏鲻虾虎鱼 毒理学评价 第4部分:生殖毒性(广东省).pdf
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1、 ICS 13.020.40 CCS Z 10 44 广东省地方标准 DB44/T 2340.42021 诸氏鲻虾虎鱼 毒理学评价 第 4 部分:生殖毒性 Mugilogobius chulaeToxicology evaluationPart 4: Reproduction toxicity 2021 - 10 - 18 发布 2022 - 01 - 18 实施 广东省市场监督管理局 发 布 DB44/T 2340.42021 I 目次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 原理 . 2 5 方法 . 2 6 器材 . 3 7 评价步骤 .
2、 3 8 质量控制 . 5 9 结果与报告 . 5 10 诸氏鲻虾虎鱼安乐死 . 6 11 实验室废弃物的处理 . 6 附录 A(资料性) 诸氏鲻虾虎鱼雌雄鉴别方法 . 7 附录 B(资料性) 诸氏鲻虾虎鱼生殖毒性评价原始记录表 . 8 附录 C(规范性) VTG mRNA 和 AR mRNA 相对表达量测定方法 . 16 DB44/T 2340.42021 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 DB44/T 2340诸氏鲻虾虎鱼 毒理学评价分为四个部分: 第 1 部分:急性毒性; 第 2 部分:摄食抑制; 第 3 部分
3、:生长抑制; 第 4 部分:生殖毒性。 本文件是DB44/T 2340的第4部分。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由广东省科学技术厅提出并组织实施。 本文件由广东省实验动物标准化技术委员会(GD/TC 93)归口。 本文件起草单位:广东省实验动物监测所。 本文件主要起草人:李建军、黄韧、朱才毅、余露军、赖素群、林忠婷、陈小曲、曾进、蔡磊。 DB44/T 2340.42021 1 诸氏鲻虾虎鱼 毒理学评价 第 4 部分:生殖毒性 1 范围 本文件规定了诸氏鲻虾虎鱼毒理学评价中生殖毒性的原理、方法、器材、评价步骤、质量控制、结果与报告、安乐死和实
4、验室废弃物处理等要求。 本文件适用于直接或间接排入海洋、入海河口的污染物及受纳水体的生殖毒性评价。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中, 注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 35517-2017 化学品 鱼类生殖毒性短期试验方法 SN/T 3592 实验室化学药品和样品废弃物处理的标准指南 DB44/T 2340.1-2021 诸氏鲻虾虎鱼 毒理学评价 第1部分:急性毒性 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 生殖毒性 reproductiv
5、e toxicity 指外源物质对雄性和雌性生殖功能或能力以及对后代产生的不良效应。 卵黄蛋白原 vitellogenin, VTG 一种磷脂糖蛋白,卵黄蛋白的前体,通常存在于卵生动物性成熟雌性个体中。 来源:GB/T 35517-2017,2.1.3,有修改 雄激素受体 androgen receptor, AR 一种配体依赖性的反转录调节蛋白,介导脊椎动物雄激素的多向效应,对性别分化、性成熟和精子发生起重要作用。 最大耐受浓度 maximum tolerated concentration, MTC 受试物引起小于10%死亡率的最高试验浓度。 来源:GB/T 35517-2017,2.1.
6、4 无可见影响浓度 no observed effect concentration, NOEC 实验生物暴露在一组不同浓度的试验溶液一定时间后, 通过观察实验生物的不良影响, 并比较试验组与对照组统计分析结果,判定出对实验生物无显著影响(p0.05)的最大浓度。 来源:GB/T 18420.22009,3.2 DB44/T 2340.42021 2 最低可观察效应浓度 lowest observed effect concentration, LOEC 与对照相比,对受试生物产生显著(p0.05)效应的最低受试物浓度。 来源:GB/T 21828-2008,2.4 性腺指数 gonad so
7、matic index,GSI 性腺重量相对去内脏体重的比例,是性成熟度的一个指标。 参见:GSI=(GW/SW)x 100 % 式中: GW性腺重,单位为克(g); SW去内脏体重(净重),单位为克(g)。 相对生殖力 relative fecundity 指一尾雌鱼在一定产卵周期内单位体重或单位体长产出的卵子数量。 孵化率 hatching rate 从卵内破膜而出的仔鱼数量与总卵数的百分比。 不投饵存活系数 survival activity index,SAI 衡量仔鱼活力的重要指标。 参见:SAI =(N hi) i/NKi=1 式中: N起始的仔鱼数量; K仔鱼全部死亡所需的天数;
8、 Hi第i天时仔鱼的累计死亡数。 4 原理 VTG是包括性成熟鱼类在内的卵生雌性动物肝脏产生的一种特有蛋白前体,由血液循环进入卵巢,但在外源类雌激素物质的刺激下, 雄鱼肝脏也能产生该蛋白前体; 雄激素通过AR激活下游信号通路来行使其功能,外源类雄激素物质的暴露可诱导AR mRNA的表达。鱼类在污染物中暴露后,通过测定肝脏组织VTG mRNA和AR mRNA表达水平,可表征水污染物对鱼类的早期生殖毒性效应。此外,环境内分泌干扰物可通过干扰鱼类性激素水平进而导致鱼类性腺指数、生殖力、孵化率、不投饵存活系数等生殖器官发育和生殖能力指标异常,这些指标可用于评估受试物的生殖毒性。 5 方法 根据试液更换
9、频次可分为静态毒性试验、半静态毒性试验和流水毒性试验。试验期间受试物实测浓度与配制浓度偏差超过 20%或受试物稳定性不明确时,宜采用半静态毒性试验或流水毒性试验。 根据暴露时间可分为期生殖毒性试验和期生殖毒性试验。 5.2.1 期生殖毒性试验:试验周期为 21 d,以 VTG mRNA 和 AR mRNA 的表达量为主要检测指标。 DB44/T 2340.42021 3 5.2.2 期生殖毒性试验:试验周期为 90 d,其中包含持续暴露染毒期 30 d,转移至清水饲养期 60 d,以性腺指数、生殖力、孵化率、仔鱼不投饵存活系数作为主要检测指标。 6 器材 主要仪器设备 6.1.1 饲养诸氏鲻虾
10、虎鱼以及饵料生物的养殖箱、水处理设备等。 6.1.2 测定环境因子的溶氧仪、盐度计、pH 计、温度计等。 6.1.3 用化学惰性材料制成的试验容器。期生殖毒性试验试验容器体积为 2.0 L3.0 L;期生试验容器体积为 5.0 L10.0 L。 6.1.4 电子天平、高速搅拌器、高速台式冷冻离心机、荧光定量 PCR 仪、生物显微镜、解剖镜、血球计数板、超净工作台、量筒、胶头滴管、移液管、手抄网等。 诸氏鲻虾虎鱼 6.2.1 性别、规格选择 根据试验要求选择雌雄鱼。诸氏鲻虾虎鱼雌雄鉴别方法见附录A。 期生殖毒性试验应选择在水温25.0 2.0 、其它条件适宜的环境下培育的(162)周龄雄鱼,其个
11、体体长宜在平均体长的20%内。 期生殖毒性试验应选择在水温25.0 2.0 、其它条件适宜的环境下培育的(222)周龄实验鱼,其个体体长宜在平均体长的20%内。 6.2.2 质量 按DB44/T 2340.1-2021中6.2.1的规定执行。 受试物 按DB44/T 2340.1-2021中6.3的规定执行。 7 评价步骤 样品准备 7.1.1 稀释水 按DB44/T 2340.1-2021中7.1.1的规定执行。 7.1.2 贮备液配制 按DB44/T 2340.1-2021中7.1.2的规定执行。 预试验 可采用较大的等比系数设置5个等比浓度组和1个阴性对照组。若使用助溶剂应增设助溶剂对照
12、组,助溶剂的浓度应与试验组中助溶剂的最高浓度一致,试验溶液中助溶剂的最高浓度不得超过0.1。可DB44/T 2340.42021 4 不设平行组。应记录试验溶液配制过程,试验溶液配制原始记录表见附录B中表B.1。观察诸氏鲻虾虎鱼96 h的死亡情况,确定诸氏鲻虾虎鱼的最大耐受浓度(MTC)范围。 正式试验 7.3.1 试验溶液配制 期生殖毒性试验:根据预试验结果,以0.1 MTC为最高试验浓度设定至少3个等比浓度组,等比系数310之间,并设阴性对照组、0.1 g/L 17-雌二醇阳性对照组和0.1 g/L -甲基睾酮阳性对照组。每个容器试液体积1.0 L。各试验组设3个平行。 期生殖毒性试验:参
13、考期生殖毒性试验结果,设定至少3个等比浓度组,等比系数310之间,设阴性对照组、 0.1 g/L17-雌二醇阳性对照组和0.1 g/L-甲基睾酮阳性对照组。 每个容器试液体积3.0 L6.0 L。各试验组设2个平行。 若使用助溶剂应增设助溶剂对照组, 助溶剂浓度应与试验组中助溶剂最高浓度一致, 试验溶液中助溶剂的最高浓度不得超过0.1。 应记录试验溶液配制过程,试验溶液配制原始记录表见附录B中表B.1。 7.3.2 诸氏鲻虾虎鱼移入 试验开始前诸氏鲻虾虎鱼停食5 h24 h,用手抄网在驯养箱中随机捞取,移入试验容器。 期生殖毒性试验每个容器放雄鱼5尾。期生殖毒性试验每个容器放雌雄鱼各10尾。
14、在30 min内完成实验鱼分放。 7.3.3 试验环境条件 按DB44/T 2340.1-2021中7.4.3的规定执行。 7.3.4 诸氏鲻虾虎鱼投喂 每天每尾鱼投喂卤虫约30个,每个试验容器每次投喂体积不超过0.2 mL。 7.3.5 试验溶液更换 静态毒性试验不更换试验溶液。 半静态毒性试验每48 h至少更换一次试液,每次更换量不少于原试液体积的3/4。宜采用虹吸方式吸出原液,缓慢加入新液,操作过程中应避免触碰诸氏鲻虾虎鱼。 流水毒性试验每24 h至少更换一次贮备液。一个试验容器24 h的流量至少为该容器内试验溶液体积的5倍。试验期间流速变幅不大于10%。 观察和记录 7.4.1 水质因
15、子测定和行为、体表特征观察 试验溶液加入前和试验结束时分别测量溶解氧、pH值、盐度等水质因子,每天测量水温、观察诸氏鲻虾虎鱼死亡、游泳、呼吸、摄食、体色、身体弯曲、鳞片脱落等异常情况,及时移出死亡个体。观测结果记录于原始记录表中,见附录B中的表B.2。 7.4.2 VTG mRNA 和 AR mRNA 相对表达量 DB44/T 2340.42021 5 期生殖毒性试验结束时,采集同一试验容器内所有存活的诸氏鲻虾虎鱼肝脏组织混合为一个样品,液氮中保存。3个平行组为3个生物学重复样品。 肝脏组织取样按GB/T 35517的规定执行。 按附录C的方法测定各样品VTG mRNA和AR mRNA相对表达
16、量,测定结果分别记录于附录B中的表B.3和表B.4。 7.4.3 性腺指数 期生殖毒性试验结束时,100 mg/L MS-222麻醉实验鱼,逐一称量性腺(精巢或卵巢)重量和实验鱼净重(去内脏体重),结果记录于原始纪录表中,见附录B中的表B.5。 7.4.4 生殖力 期生殖毒性试验转移至清水饲养期间每天观察诸氏鲻虾虎鱼产卵情况。 雌鱼产卵后, 计数产卵量,测量雌鱼体长,结果记录于原始纪录表中,见表B.6。 7.4.5 孵化率 期生殖毒性试验转移至清水饲养期间,每批鱼卵产出后,置于稀释水中,在水温25 2 、光照54 lx524 lx、溶氧大于5 mg/L的条件下孵化,观察孵出鱼苗数 , 测定试验
17、期间测定水质, 观测结果记录于原始纪录表中,见表B.7。 7.4.6 不投饵存活系数 期生殖毒性试验转移至清水饲养期间, 每批仔鱼孵出后, 随机取100尾初孵仔鱼 (出膜2小时内) ,在DB44/T 2340.1-2021 B.2环境条件下不投饵饲养,测定试验开始和结束的水质环境因子,并每天观察仔鱼的存活数,直至仔鱼全部死亡。试验结果记录于原始纪录表中,见表B.8。计算不投饵存活系数SAI值及半数致死时间。 8 质量控制 有效的试验应符合以下条件: 试验结束时,对照组(包括阴性对照组、溶剂对照组)诸氏鲻虾虎鱼死亡率不大于 10%; 在 23 27 条件下,与阴性对照组相比,0.1 g/L 的
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