植物乳杆菌LAB2对辣椒软腐病的控制作用及辣椒贮藏品质的影响.pdf
《植物乳杆菌LAB2对辣椒软腐病的控制作用及辣椒贮藏品质的影响.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《植物乳杆菌LAB2对辣椒软腐病的控制作用及辣椒贮藏品质的影响.pdf(9页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIESD0I:10.13995/ki.11-1802/ts.033667引用格式:李晓芬,李广,曾凯芳,等.植物乳杆菌LAB2对辣椒软腐病的控制作用及辣椒贮藏品质的影响J.食品与发酵工业,2023,49(17):136-144.LI Xiaofen,LI Guang,ZENG Kaifang,et al.Soft rot controlling of pepper by Lactobacillus planta-rum LAB2 and its effect on storage quality of pepperJJ.Food
2、 and Fermentation Industries,2023,49(17):136-144.植物乳杆菌LAB2对辣椒软腐病的控制作用及辣椒贮藏品质的影响李晓芬,李广1,曾凯芳1-2,易兰花1.2*1(西南大学食品科学学院,重庆,40 0 7 15)2(西南大学食品贮藏与物流研究中心,重庆,40 0 7 15)摘要细菌性软腐病是辣椒采后主要病害之一,该研究旨在探究拮抗乳酸菌控制辣椒软腐病的应用潜力。胡萝卜软腐病果胶杆菌CBJ3(Pc c CBJ3)致病性分析表明2 5(3 lgCFU/mL)和4(8 lgCFU/mL)贮藏下,均可致辣椒软腐率达10 0%,致腐性极强。从辣椒上筛选出一株对P
3、ccCBJ3有强抑菌活性的拮抗菌LAB2,经16S rDNA鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。L.p l a n t a r u mLA B2 所产细菌素以及无细胞发酵液(cell-freefermentation supernatant,C FS)对PccCBJ3均有体外抑菌活性。通过基因组草图序列在数据库比对鉴定到了4个细菌素:plantaricin_E、p l a n t a r i c i n _F、p l a n t a r i c i n _N和plantaricin_J。体内控病试验表明L.plantarumLAB2所产细菌素和CFS对辣椒软腐病
4、均有控制效果,且CFS控病能力更强,显著降低了软腐病发病率和病斑直径(P0.05)。扫描电镜显示,CFS处理可维持辣椒表皮结构的完好性。微生物计数结果表明,CFS处理可显著降低辣椒上的病原菌数量(P0.05)。进一步研究结果显示,CFS处理可显著延缓辣椒贮藏期的硬度下降、失水、可溶性固形物含量流失、丙二醛的积累(P0.05)。该研究为辣椒采后藏保鲜生物防治技术应用提供参考。关键词辣椒;软腐病;拮抗菌;控病作用;贮藏品质辣椒(Capsicum spp.)是一种蔬菜,也是一种调味品,因营养价值丰富、口感独特受到消费者的喜爱和欢迎。我国是世界上辣椒栽培面积最大的国家,“十三五”以来,我国辣椒年播种面
5、积占全国蔬菜总播种面积的8%10%,产值约2 50 0 亿元,播种面积和产值均居蔬菜首位 。但辣椒采后损失巨大,常见的病害有果腐病(Fusarium sp.引起)、软腐病(Er-winia引起)、炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides 引起)、黑斑病(Alternaria alternata引起)、疫病(Phyto-phthor acapsici引起)和灰霉病(Botrytis cinerea 引起)。其中,软腐病是辣椒采后最具毁灭性的细菌性病害2 。果胶杆菌(Pectobacterium)是引发辣椒软腐病的主要病原菌,它通过产生多种细胞壁降解酶导致蔬菜腐烂3 。
6、病原菌通过伤口或自然孔道侵染植物组织,采收和物流运输中产生的机械损伤能够促进病原菌的侵染,从而加重软腐病造成的经济损失。控制辣椒采后软腐病的发生是辣椒产业急需解决的问题。目前,由微生物侵染引起的辣椒病害主要通过化学杀菌剂进行防治。然而,化学杀菌剂控制软腐病具有持久性差、环境污染、细菌菌群可产生耐药性等问第一作者:硕士研究生(易兰花讲师为通信作者,E-mail:)基金项目:四川省科技计划重点研发项目(2 0 2 1YFQ0071);国家自然科学基金青年项目(3 2 10 2 0 3 2);中央高校基本科研业务费专项资金(SWU-KT22047)收稿日期:2 0 2 2-0 9-16,改回日期:2
7、 0 2 2-11-0 11362023 Vol.49 No.17(Total 485)题4,使得人们不断地探索新型杀菌剂。拮抗微生物及其代谢产物被认为有望代替传统化学杀菌剂5。乳酸菌可以通过产生大量的有机酸、细菌素等抑菌物质来抑制食物腐败微生物和致病微生物6-7 ,且具有“一般被认为是安全的(generlly recog-nized as safe,GRAS)”安全等级 。此外,它们具有“合格的安全推定(qualified presumption of safety,QPS)”,能够有选择地对食品细菌性病原菌进行纳米级的抗菌防御,从而保障消费者的安全 。因此,乳酸菌在食品贮藏保鲜中具有巨大的
8、应用潜力。乳酸菌及其代谢产物在果蔬贮藏领域已经有了初步的应用研究。VOIDAROU等【10 利用乳酸菌及其代谢产物对梨、苹果、桃、西红柿、黄瓜、红辣椒、白菜和胡萝卜的致病微生物进行了有效的控制。YI等 利用戊糖乳杆菌MS031对鲜切果蔬中食源性致病菌进行了控制,对大肠杆菌、沙门氏菌和单核增生李斯特菌显示出较好的抑菌活性。蔡文韬等12 利用解淀粉芽孢杆菌发酵液对辣椒进行保鲜,可以延缓果实内还原糖、可溶性固形物、蛋白和维生素C含量的降低,保持了辣椒较稳定的色泽和质地。目前,乳酸菌对辣椒研究报告软腐病控制还鲜有报道。实验室前期从辣椒果实上1.3.24贮藏下的致病性分离得到了一株胡萝卜软腐病果胶杆菌胡
9、萝卜亚种消费者在购买辣椒后,通常贮存在常温或家用冷(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum,Pcc)藏冰箱中,因此本文还探究了在4下贮藏时,不同CBJ3菌株,本文旨在探究该软腐病病原菌在不同贮浓度果胶杆菌Pcc CBJ3对辣椒的致病力。处理过程藏温度下对辣椒的致病性,进一步利用拮抗菌L.同1.3.1节,除了辣椒贮藏在4冷库中。每天记录plantarumLAB2控制辣椒软腐病,并探究其对辣椒贮发病率和病斑直径。藏品质的影响,本研究可为减少辣椒软腐病害以延长1.4拮抗菌对软腐病菌的体外控病活性贮藏期提供新的技术方法。1.4.1拮抗菌的筛选将实验室从
10、辣椒上分离得到的10 8 株细菌作为1材料与方法筛选对象,以果胶杆菌Pcc CBJ3为指示菌,采用双层1.1主要材料与试剂划线法141筛选具有抑菌活性的拮抗菌。辣椒采自重庆市北碚区(本文辣椒均指辣椒果1.4.2拮抗菌不同组分的控病活性实);果胶杆菌PccCBJ3、L.p la n t a r u m LA B2 保藏于西将筛选得到的拮抗菌在MRS液体培养基中南大学食品科学学院食品贮藏与物流实验室。37摇瓶培养2 4h,离心获得的菌体沉淀用无菌生胰蛋白陈、酵母提取物、琼脂粉,北京奥博星生物理盐水重悬至OD600mm=0.1。抗菌摇瓶培养48 h,技术有限公司;(NH4)SO 4、Na C1O,成
11、都科隆化学品离心,上清液用0.2 2 m滤膜过滤,得到无细胞发酵有限公司;丙酮、三氯乙酸、甲醇、NaCl,重庆跃翔化工液(cell-free supernatant,CFS)。采用(NH4),SO 4 沉有限公司;MRS培养基,金克隆生物试剂有限公司;淀法15,在10 0 mLCFS中加人8 0%(质量分数)饱细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒抽提试剂盒,上海和(NH4),SO 0 4溶液,4放置2 4h,离心,沉淀溶解于生工生物工程有限公司。1 mL磷酸缓冲液(pH6.0)即得细菌素粗样。参考1.2主要仪器XU等16 的方法,以果胶杆菌Pcc CBJ3为指示菌,利灭菌锅,厦门致微仪器有限公司;
12、生化培养箱,上用琼脂孔扩散法进行体外抑菌实验,并记录抑菌圈直海跃进医疗器械有限公司;摇床,上海曼泉仪器有限径。每个处理3 个重复。公司;AvantiJ-30I高速冷冻离心机,美国Beckman公1.5拮抗菌基因组草图测序司;SIGMA1-15PK小型台式离心机,德国SIGMA公将拮抗菌培养至对数期,基因组DNA提取、DNA司;超净台,苏州安泰空气技术有限公司;PCR仪、电文库构建及IlluminaHiSeq4000平台测序由北京诺转仪,上海伯乐生命医学产品有限公司;扫描电镜,上禾致源科技股份有限公司完成。将拮抗菌草基因组海复纳科学仪器有限公司;硬度计GS-15,北京阳光序列应用到细菌素数据库B
13、AGEL4(h t t p:/b a g e l 4.亿事达科技有限公司;UV1000紫外可见分光光度molgenrug.nl/index.php)进行细菌素的鉴定。计,上海天美公司;WYT0-80%数显手持式折光仪,成1.6拮抗菌对辣椒软腐病的体内控病活性都兴晨光光学仪器有限公司。拮抗菌不同组分的制备过程同1.4.2 节。果胶1.3不同贮藏温度下果胶杆菌对辣椒的致病性杆菌PccCBJ3重悬于无菌生理盐水至浓度约为1.3.125贮藏下的致病性103CFU/mL,随后按照1.3.1节处理辣椒。辣椒每用2%(体积分数)NaCIO对新鲜完好的辣椒进孔中分别加人3 0 L拮抗菌菌悬液、CFS、粗细菌素
14、,行浸泡2 min消毒,清水洗净,自然晾干,无菌打孔器并以无菌生理盐水作为对照。晾干后贮藏于2 5,打2 个孔,待用。果胶杆菌Pcc CBJ3在LB肉汤中培每天记录发病率和病斑直径。每个处理3 个重复,每养至对数期,离心收集菌体,并重新悬浮于无菌生理个重复10 个辣椒。盐水至0 D00m=0.5(110CFU/mL),随后将其101.7扫描电镜观察倍逐级稀释至浓度为10 CFU/mL。取3 0 L各稀释按照1.6 节步骤在辣椒孔中接种病原菌Pcc度菌悬液分别接种于辣椒孔中,晾干后放置于2 5CBJ3和进行CFS处理。取辣椒伤口附近的植物组贮藏,每天记录发病率和病斑直径13 。以无菌水代织,取样
15、面积约为5mm5mm。随后,将样品在替菌悬液作为对照。每个浓度3 个重复,每个重复4下2.5%(体积分数)戊二醛溶液中进行过夜浸10个辣椒。泡固定,次日分别用2 0%、3 0%、40%、50%、7 0%、2023 年第 49 卷第17 期(总第 48 5 期)13 7食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES90%(体积分数)的乙醇进行脱水,再用10 0%的乙醇脱水2 遍,每次脱水时间为3 0 min。样品干燥后,用扫描电镜以50 0 0 的放大倍数进行观察。1.8CFS对辣椒中绿色荧光标记PccCBJ3生长的影响为了追踪病原菌在辣椒上的生长情况,果胶杆菌PccC
16、BJ3使用绿色荧光蛋白进行标记。PccCBJ3于新鲜的LB液体培养基中,3 7 培养至OD600mm=0.30.5。随后,利用预冷的CaCl2溶液制备PccCBJ3感受态细胞。接着,参考董爱菊等17 的方法,将实验室前期研究已构建的绿色荧光蛋白重组质粒pCR2.1-TOPO-GFP电转化至PccCBJ3感受态细胞。在含有卡那霉素的LB平板培养后,挑取带有绿色荧光的菌落并进行甘油保藏。按照1.6 节步骤在辣椒孔中接种绿色荧光标记Pcc CBJ3和进行CFS处理。每天取果实伤口处植物组织样品进行微生物计数。无菌生理盐水代替CFS作为对照。每个处理5个重复。1.9CFS对辣椒贮藏品质的影响按照1.6
17、 节步骤在辣椒孔中接种病原菌PccCBJ3和进行CFS处理。无菌生理盐水代替CFS作为对照。每个处理3 个重复,每个重复3 0 个辣椒。伤口附近1cm内进行辣椒组织取样,用液氮迅速冷冻后,样品存于-8 0 冰箱,待用。1.9.1硬度使用硬度计测定辣椒伤口附近组织的硬度。1.9.2可溶性固形物(soluble solids content,SSC)不同处理取等质量的样品,研磨后过滤,用手持式糖度计测定滤液中的SSC质量分数。1.9.3失重率每天对辣椒称重。失重率=(起始辣椒重量一当天辣椒重量)/起始辣椒重量。1.9.4丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量参考SHU等18 的方法测
18、定MDA含量并进行一定的修改。取0.5g辣椒样品,加入5mL5%(体积分数)三氯乙酸,研磨后所得勾浆转移至离心管中,接着用5mL三氯乙酸洗研钵,并将洗液收集于同一离心管中。离心,取上清液2 mL,加硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)2 mL,混合后在10 0 水浴中煮沸3 0 min,分别测450、53 2、6 0 0 nm吸光度值,并按以下公式计算MDA浓度。MDA的含量以每克果蔬组织鲜重中所含MDA的物质的量(mol/gFW)表示。1382023 Vol.49 No.17(Total 485)c/(mol/L)=6.45(A 53 2 -A 6 0 0)-0.5
19、6 A 450式中:A532A600、A 450,分别为上述反应液在53 2、6 0 0、450nm处的吸光值;c,MDA的浓度,mol/L。1.10数据处理所有实验进行3 次重复,数据结果的表示均为平均值标准差。使用GraphPadPrism8.3.0制图,采用SPSS22.0软件进行数据分析。使用单因素AVOVA检验和独立样本T检验进行显著性分析。2结果与分析2.17不同贮藏温度下果胶杆菌对辣椒的致病性2.1.125贮藏下的致病性如图1-a所示,在2 5下,接种不同浓度病原菌后的辣椒随贮藏时间延长,腐烂程度加重,且不同浓度下腐烂率有明显差异。如图1-b所示,接种浓度3lgCFU/mL果胶杆
20、菌PccCBJ3时,贮藏至第3 天,辣椒软腐病发病率均达到10 0%。此时辣椒完全腐烂,呈水滞状,散发出恶臭(图1-a,第3 天)。当病原菌接种浓度为2 lgCFU/mL时,贮藏第3 天,辣椒腐烂率仍达到(8 513.2 2)%。当病原菌接种浓度为1lgCFU/mL时,在第3 天保持较低的发病率(8.3%)。AKBAR等19 将浓度为8 lg CFU/mL软腐病菌Pcc接种至不同的植物宿主中,在室温下放置12 d,Pcc对辣椒的致病力最强,其次是番茄,马铃薯;它们的软腐病病斑直径分别为2 2.3、7.9、7.8 mm。在本研究中,果胶杆菌PccCBJ3浓度低至3 lgCFU/mL时仍能够导致辣
21、椒腐烂率达到10 0%,这也证明了Pcc对辣椒具有较强的致病力。2.1.24贮藏下的致病性如图2-a所示,不同浓度果胶杆菌PccCBJ3对辣椒的致病力有显著差异。当病原菌接种浓度为8lgCFU/mL时,辣椒在贮藏第2 1天时腐烂率达到100%(图2-b)。由图2-b和图2-c可知,当病原菌接种量为7 lgCFU/mL时,辣椒在贮藏第2 3 天时的发病率为(58.3 3 17.56)%,病斑直径为(44.17 3.82)m m;当病原菌接种量为6 lgCFU/mL时,辣椒在贮藏第2 3 天时的发病率仅为(8.3 3 16.6 3)%,病斑直径为(12.6 7 2.2 6)mm。这说明在4贮藏时,
22、高浓度的Pcc CBJ3对辣椒的致病力较强。与常温相比,在低温下PccCBJ3的致病能力受到显著抑制。2.2拮抗菌对辣椒软腐病病原菌的体外抑菌活性从10 8 株细菌中筛选得到了1株细菌LAB2对果胶杆菌PccCBJ3有抑菌效果(图3-a),其抑菌圈直(1)研究报告od1da对照6 lg CFU/mL5 1g CFU/mL2d3d4 lgCFU/mL3lgCFU/mL2 lg CFU/mL1 IgCFU/mLb120%/80400Fig.1Effects of different concentrations of Pcc CBJ3 on the pepper soft rot at 25 Ca
23、od8 1g CFU/mL7 IgCFU/mL6 1gCFU/mL81gCFU/mL7 1gCFU/mL6lgCFU/mL6lgCFU/mL51gCFU/mL4.igCFU/mL1贮藏时间/da-病害症状;b-发病率;c一病斑直径图12 5下不同浓度PccCBJ3对辣椒软腐病的影响7d11d15d17d31gCFU/mL2igCFU/mLIgCFU/mL23C8060402009d19d61gCFU/mL5IgCFU/mL4.IgCFU/mL3IgCFU/mL-2igCFU/mL-1 Ig CFU/mL贮藏时间/d21d2313d23db1209060300Fig.2Effect of dif
24、ferent concentrations of Pcc CBJ3 on the pepper soft rot at 4 C8081gCFU/mL-6 lg CFU/mLs7 Ig CFU/mL791113151719 2123贮藏时间/da-病害症状;b-发病率;c-病斑直径图24下不同浓度PccCBJ3对辣椒软腐病的影响8 1g CFU/mL7 g CFU/mL606 1g CFU/mL40200王7911131517192123贮藏时间/d2023年第49 卷第17 期(总第48 5期)139食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES径为(45.7 0.5
25、8)mm。菌株LAB2经16 SrDNA测序鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。为了进一步探究该乳酸菌发挥抑菌效果的有效成分,进行了发酵液不同组分的体外活性实验。结果显示CFS(图3-c)和粗细菌素(图3-d)均对果胶杆菌 Pcc CBJ3a具有抑菌活性,而菌体(图3-b)无抑菌活性。和粗细菌素相比,CFS显示出更好的抑菌效果,我们推测在CFS中还含有细菌素以外的其他抑菌物质在起作用。L.plantarum被报道可产生多种具有抑菌活性的代谢产物,如有机酸、H,0,、CO,、双乙酰、细菌素等2 0 。bCda-双层划线法筛选拮抗菌;b-菌体;c-CFS;d-细菌素
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 植物 杆菌 LAB2 辣椒 软腐 控制 作用 贮藏 品质 影响
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。