周期性拉伸通过组蛋白乳酸化修饰调控平滑肌细胞增殖功能.pdf
《周期性拉伸通过组蛋白乳酸化修饰调控平滑肌细胞增殖功能.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《周期性拉伸通过组蛋白乳酸化修饰调控平滑肌细胞增殖功能.pdf(7页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、论 著文章编号(23)5-0494-07周期性拉伸通过组蛋白乳酸化修饰调控平滑肌细胞增殖功能陈鑫,吕慧珍,艾玎(天津医科大学基础医学院生理学与病理生理学系,天津300070)摘要 目的:利用细胞单轴周期性拉伸模型,探究静脉移植手术后的周期性拉伸应力对血管平滑肌细胞(VSMC)组蛋白乳酸化修饰的影响。方法:使用细胞单轴周期性拉伸装置,对大鼠原代VSMC给予拉伸幅度15%、频率1 Hz的拉伸刺激来模拟动脉的周期性拉伸,对照组以细胞静止于拉伸小室来模拟静脉的拉伸状态。细胞收样后,使用Western印迹检测VSMC周期性拉伸24h前后的增殖细胞核抗原(PCNA)和平滑肌肌动蛋白(-SMA)的蛋白水平,
2、qPCR检测平滑肌细胞增殖和分化基因的mRNA水平。随后用比色法检测周期性拉伸前后细胞内的乳酸含量,并提取在两种不同力学条件下处理24 h的VSMC的组蛋白来检测泛和位点特异性的乳酸化修饰水平。结果:Western印迹结果说明,和静息状态相比,VSMC周期性拉伸24 h后的PCNA蛋白水平没有明显变化(P=0.777),-SMA的蛋白水平下降(t=4.715,P0.01)。qPCR结果显示,和静息状态相比,PCNA的mRNA水平在VSMC周期性拉伸12 h后上升,24 h恢复到初始水平;细胞周期蛋白Ccnd1和Cdk6的mRNA水平呈时间依赖性上升,细胞周期依赖性激酶抑制剂Cdkn1a和分化相
3、关基因Acta2、Tagln的mRNA水平呈时间依赖性下降。比色法结果显示,和静息状态相比,VSMC周期性拉伸24 h后的乳酸积累增加(t=5.554,P0.01)。Western印迹结果显示,和静息状态相比,VSMC周期性拉伸24 h后的泛乳酸化修饰水平上升(t=3.603,P0.01),特异性位点乳酸化修饰如H3K9la、H3K14la和H3K18la的水平均增加。与静息状态(0 h)相比,H3K9la、H3K14la和H3K18la的水平显著增加(t=6.001、6.966、12.750,均P0.000 1)。结论:周期性拉伸后VSMC的代谢状态发生改变,糖酵解的最终代谢产物乳酸积累增加
4、,组蛋白乳酸化修饰水平也增加,这可能是引起VSMC增殖的原因。关键词周期性拉伸;乳酸;组蛋白乳酸化修饰;血管平滑肌细胞中图分类号R363.1+文献标志码Cyclic stretch regulates smooth muscle cell proliferation through histone lactylation modificationCHEN Xin,LYU Hui-zhen,AI Ding(Department of Physiology and Pathophysiology,School of Basic Medical Sciences,Tianjin Medical Un
5、iversity,Tianjin 300070,China)AbstractObjective:To investigate the effect of cyclic stretch(CS)stress on histone lactylation modification in vascular smooth musclecells(VSMC)after vein graft surgery using a cellular uniaxial cyclic stretching model.Methods:Using a uniaxial cyclic stretching device,t
6、he primary VSMCs of rats were subjected to stretch stimulus with a stretch amplitude of 15%and a frequency of 1 Hz to simulate the cyclicstretch of arteries,while cells static in the stretch chamber were to simulate the cyclic stretch of veins and served as control.After cellcollection,Western blott
7、ing was used to detect PCNA and-SMA protein levels before and after 24 h of cyclic stretching in VSMC.ThemRNA levels of VSMC proliferation and differentiation-related genes were detected by qPCR.Subsequently,the intracellular lactate levelsbefore and after cyclic stretch were detected by colorimetri
8、c assay.Histones of VSMC treated under two different mechanical conditions for24 h were extracted for detection of pan-and site-specific lysine lactonization levels.Results:Western blotting results showed that theprotein level of PCNA did not change significantly after 24 hours of cyclic stretch of
9、VSMC compared with the static state(P=0.777),but-SMA decreased(t=4.715,P0.01).The qPCR results showed that the mRNA levels of PCNA increased after 12 h ofVSMC cyclic stretch and returned to basal level at 24 h.The mRNA levels of cell cycle proteins Ccnd1 and Cdk6 increased in a time-dependent manner
10、,and the mRNA levels of cell cycle-dependent kinase inhibitor Cdkn1a,differentiation-related genes Acta2 and Taglndecreased in a time-dependent manner.Colorimetric assay showed the accumulation of lactic acid in VSMC after 24 hours of periodicstretching elevated compared to static state(t=5.554,P0.0
11、1).Western blotting resultsshowedanincreaseinthelevelofpan-lysinelactationof VSMC after 24 hours of cyclic stretching compared to the static state(t=3.603,P0.01),including significant elevation of site-specificlactation modifications such as H3K9la,H3K14la and H3K18la(t=6.001,6.966,12.75,all P0.000
12、1).Compared with the resting state(0 h),the levels of H3K9la,H3K14la,and H3K18la were significantly increased.Conclusion:After cyclic stretch,the metabolic state ofVSMC is altered,the accumulation of lactate as the final metabolite of glycolysis increases and the level of histone lactylation modific
13、ationsalso increases,which may be the cause of VSMC proliferation.基金项目 国家自然科学基金青年科学基金项目(8 2 0 0 0 4 2 3)作者简介 陈鑫(1 9 9 8-),女,硕士在读,研究方向:生物学;通信作者:艾玎,E-m a il:e d in 2 0 0 0 c n 1 6 3.c o m。天津医科大学学报Journal of Tianjin Medical University第29卷5期23年9月 29熏 5Sep.23494Key wordscyclic stretch;lactate;histonelact
14、ylation modification;smooth muscle cells冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)是世界范围的内主要致死病因。冠状动脉旁路手术是最常用于治疗闭塞性冠状动脉粥样硬化病变的策略之一1。该手术通过移植患者自身其他部位的血管来代替因动脉粥样硬化斑块而堵塞的病变血管,重新恢复该血管的血流从而达到治疗目的。手术常用自体隐静脉,但与动脉移植相比,静脉移植的通畅率通常不高2。早期(移植1个月内)造成通畅率不高的原因通常是急性血栓的生成,晚期(2年)通畅率不高的原因通常是内膜增厚和动脉粥样硬化3-4。有研究发现,由动脉循环高压引起的高水平的周期性拉伸可导致静脉移植物管壁平滑肌细胞
15、功能和状态改变,进而促进血管重塑的重要因素,其具体机制目前还未充分得到研究。组 蛋白修饰是基因表达的表观调控层面之一,它可以通过改变染色体的疏松程度来影响转录因子与基因的亲和性从而调控基因表达。近年来发现了各种新型的组 蛋白修饰标记,如丙酸化、丁酰化、琥珀酰化、丙二酰化、戊二酰化和巴豆酰化。2019年芝加哥大学赵英明教授课题组 在 Nature 杂志报道了全新的蛋白翻译后修饰(posttranslational modifications,PTMs)类型乳酸化修饰。该研究证实H3K18la位点的修饰直接刺激基因转录从而参与调控巨噬细胞的M1/2极化,糖酵解衍生的乳酸被确定为组 蛋白乳酸化的底物
16、5。本研究旨在研究血管平滑肌细胞(VSMC)在周期性拉伸后是否存在乳酸积累的增加和组 蛋白乳酸化修饰的增加,为阐明代谢重编程和表观遗传修饰在这一力学刺激过程中的作用与机制作出探索。1材料与方法1.1实验材料RNA提取试剂盒(北京全式金公司),Taqq-PCR Mix(美国Thermo公司),DMEM培养基(美国Gibco公司),胎牛血清(美国Gibco公司),鼠抗GAPDH抗体(美国Proteintech公司),兔抗平滑肌肌动蛋白(-SMA)抗体(PTM-5216)(杭州景杰生物科技有限公司),乳酸含量检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司),兔抗L-Lactyl Lysine、Lactyl-Hi
17、stone H3(Lys9)、Lactyl-Histone H3(Lys14)、Lactyl-Histone H3(Lys18)抗体(杭州景杰生物科技有限公司),兔抗H3抗体(北京索莱宝科技有限公司),细胞拉伸培养室(广州市华粤行仪器科技有限公司),荧光实时定量PCR仪(美国Thermo公司),NST-1400-04-R5细胞拉伸仪(日本Nepa Gene公司),恒温细胞培养箱(美国Thermo公司)。1.2实验方法1.2.1大鼠主动脉平滑肌细胞的分离和培养取Sprague-Dawley(SD)大鼠(150 g),麻醉后固定到手术板上,开胸,沿着脊柱取腹主动脉到主动脉弓的一段血管,用显微剪去除
18、血管周围的结缔组 织,显微镜下小心撕去血管外膜留下中膜部分,剪碎,用滴管转移到培养瓶中,两周后细胞生长融合。传代到P5用于实验,每代培养到80的密度时传代。1.2.2蛋白质免疫印迹和杂交实验用细胞裂解液提取细胞的蛋白质,使用细胞超声破碎仪破碎细胞(3 s/次,超声3个循环),12 000 r/min下4离心10 min,收集上清液,用BCA法测好浓度后计算所需上样量,加入SDS上样缓冲液,100变性10 min。制备不连续的SDS-PAGE凝胶,上样,跑胶,用快速湿转仪设定的程序转膜,室温脱脂牛奶封闭1 h,之后依次孵育一抗和二抗,最后用ECL显色曝光,Image J进行后续的定量分析。1.2
19、.3细胞总RNA的提取和qPCR使用全式金RNA提取试剂盒,按照 说明书提取细胞的RNA后,再按照 逆转录试剂盒两步法合成cDNA,按照2Taqq-PCR Mix(10 L),cDNA和RNAasefree水(总体积为9 L),qPCR引物(1 L)。具体的程序为:预变性:95,300 s;设置40个循环:变性:95,30 s,退火:60,30 s,延伸:72,30 s;溶解:95,30 s,60,30 s,72,30 s。根据qPCR得出的荧光曲线的Ct值,以GAPDH基因为内参,用2-Ct计算结果。所用到的引物序列见表1。注:Pcna:增殖细胞核抗原;Acta2:平滑肌肌动蛋白2;Tagl
20、n:转运蛋白基因;Gapdh:内参基因;Cdk6:周期蛋白依赖性激酶6;Ccnd1:细胞周期蛋白D1;Cdkn1a:细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A表1qPCR所需的引物序列Tab 1Primer sequences for qPCR基因名称(种属rat)PcnaActa2TaglnGapdhCdk6Ccnd1Cdkn1a引物序列(53)TTTCACAAAAGCCACTCCACTGCTTTAAGTGTCCCATGTCAGCAATTGACCCTGAAGTATCCGTCCAGAGTCCAGCACAAAGGACTGTAATGGCTTTGGTGTGAACTCCCTCTTATGCTACCCAGAAGAC
21、TGTGGATGGCACATTGGGGGTAGGAACACTGGACCTCTGGAGTGTTGGTTGGGCAGATTTGGAGGCGTACCCTGACACCAATTCTTCGCACTTCTGCTCCGCAAAGTATGCCGTCGTCTCAAAGTTCCACCGTTCTCG产物(bp)103295111171183179111陈鑫,等.周期性拉伸通过组 蛋白乳酸化修饰调控平滑肌细胞增殖功能第5期495图1细胞拉伸仪示意图Fig1Diagram of cell stretching instrument1.2.4组 蛋白提取收集细胞,并用冰PBS洗涤两次。可以在PBS和后续的缓冲液中补加5 m
22、mol/L丁酸钠,以保持组蛋白的乙酰化水平。将细胞重悬于TEB提取缓冲液TEB:含0.5%Triton100(v/v)、2 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)和0.02%NaN3(w/v)的PBS,细胞密度为107个/mL。轻柔搅拌,冰上裂解细胞10 min。4以650 g的离心力离心沉淀细胞核10 min。去除并丢弃上清液。用一半体积的TEB洗涤细胞核,并按照 前述方法进行离心。在0.2 mol/LHCl中重悬沉淀,随后4过夜,第二天在4以650 g的离心力离心样本10 min后收集上清液(含组蛋白),加入等量的50%三氯乙酸,冰上混匀30 min,10 000 r/min离心10 min
23、,收集沉淀,冰丙酮洗涤沉淀,10 000 r/min离心10 min,风干,将沉淀溶解在高压水中。测量蛋白浓度后存储于-80。1.2.5细胞内乳酸含量测定在107个细胞中加入1 mL提取液一,冰浴超声波破碎细胞(功率300 W,超声3 s,间隔7 s,总时间3 min);4,12 000 g离心10 min,取0.8 mL上清液,再加入0.15 mL提取液二,4 12 000 r/min离心10 min后留取上清待测。根据说明书配制标准品,将测定管、对 照 管和空白管于570 nm处测定吸光值,利用标准曲线得到细胞内的乳酸含量。1.2.6细胞单轴周期性拉伸装置的使用在使用细胞拉伸仪之前,使用7
24、5%酒精对 仪器整体进行消毒,特别是拉伸小室安装的区域。细胞拉伸系统在运行时需要提前准备冷却水并连接至水泵,拉伸单元放置于孵箱里,控制单元放置在孵箱外(图1)。(1)设置好频率和幅度后打开控制单元总电源开关,打开后开关灯闪烁绿光。(2)按下START按钮,拉伸小室支架随之开始移动,此时按钮灯会闪烁绿光。(3)按下STOP按钮,拉伸室支架停止移动。(4)拉伸完毕后关闭总电源和水泵开关。既往研究中常用的拉伸幅度和频率条件有:25%、1 Hz6-8,20%、1 Hz9-10,15%、1 Hz11,10%、0.5 Hz12,10%、1 Hz13及10%、1.25 Hz14-15。1.3统计学处理符合正
25、态分布的计量资料以表示,两组间比较采用非配对t检验,多组 间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),P0.05为差异有统计学意义。结果部分中标注的实验结果的次数(n),是多次实验重复获得的样本数量。采用GraphPad Prism6统计软件进行统计和画图。2结果2.1周期性拉伸后VSMC的收缩和增殖相关基因表达的改变周期性拉伸的频率和幅度对 细胞的功能改变也不相同,笔者确定了拉伸幅度15%、频率为1 Hz的周期性拉伸作为模拟动脉循环中VSMC受到的力学条件,静止于拉伸小室作为模拟静脉循环中VSMC受到的力学条件。当VSMC处于上述两种力学条件24 h后收集细胞的蛋白和RNA,通过
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 周期性 拉伸 通过 组蛋白 乳酸 修饰 调控 平滑肌 细胞 增殖 功能
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。