脂质运载蛋白2自限性抑制间充质干细胞的成骨细胞分化.pdf
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1、脂质运载蛋白脂质运载蛋白2 2自限性抑制间充质干细胞的成骨细胞分化自限性抑制间充质干细胞的成骨细胞分化陈梓锋1,3,李胜发2,张祐鸣3,杨婉雯3,王 婷31广州市番禺区中心医院创伤骨科,广东 广州 511400;2南方医科大学珠江医院临床研究中心,广东 广州510260;3南方医科大学基础医学院细胞生物学,广东 广州 510515Lipocalin 2 induces self-limited inhibition of osteoblast differentiation of mesenchymalstem cellsCHEN Zifeng1,3,LI Shengfa2,ZHANG You
2、ming3,YANG Wanwen3,WANG Ting31Department of Orthopedics,Panyu Central Hospital,Guangzhou 511400,China;2Department of Clinical Research Center,ZhujiangHospital,Southern Medical University,Guangzhou 510260,China;3Department of Cell Biology,School of Basic Medical Sciences,SouthernMedical University,Gu
3、angzhou 510515,China摘要:目的 探究脂质运载蛋白2(Lcn2)在骨发育和老年性骨质疏松的作用。方法 C3H10T1/2 MSC细胞用成骨诱导液诱导3 d或不作处理(control),收集细胞核提取染色质,以H3K27A和H3K9Me3抗体进行免疫沉淀;ChIP-seq分析了诱导成骨分化前后C3H10T1/2间充质干细胞Lcn2基因座位的修饰组蛋白结合情况;ROSE软件(利用H3K27AC信号计算)显示成骨诱导后出现超级增强子;RNA-seq结果证实Lcn2在C3H10T1/2成骨诱导后上调的倍数在所有基因中位列第4;逆转录-实时定量PCR结果用于证实Lcn2的mRNA水平在
4、C3H10T1/2成骨诱导后上调;蛋白质组学分析了16月龄C57BL/6J雄鼠相对于3月龄雄鼠股骨远端总蛋白表达谱的差异。iTRAQ-MS/MS用于分析,16月龄的老年雄鼠的松质骨中Lcn2蛋白表达相对于3月龄雄鼠的差异;ELISA检测3月龄和16月龄老年雄鼠血清中Lcn2含量;用50、100、200、500 ng/mL浓度的Lcn2重组蛋白处理C3H10T1/2后以ALP检测成骨分化能力,以Westem blot检测早期成骨转录因子OSX和晚期成骨指标OCN。结果 iTRAQ-MS/MS结果显示,16月龄的老年雄鼠的松质骨中Lcn2蛋白表达相对于3月龄雄鼠明显上调(P0.01)。与此对应,E
5、LISA结果示16月龄老年雄鼠血清中Lcn2含量比3月龄对照(control)雄鼠明显升高(P0.01)。ALP染色结果和定量结果显示加入100、200、500 ng/mL浓度Lcn2 RP后ALP表达减弱(P0.05,P0.01,P0.01)。Westem blot定量结果显示OSX在100、200、500 ng/mL浓度的Lcn2 RP组中的表达减低,呈剂量依赖性(P0.05)。Westem blot定量结果显示OCN在100、200、500 ng/mL浓度的Lcn2 RP组中的表达减低,呈剂量依赖性(P0.05,P0.01,P0.001)。ROSE软件(利用H3K27AC信号计算)显示成
6、骨诱导后Lcn2基因区域出现超级增强子。RNA-seq结果证实Lcn2在C3H10T1/2成骨诱导后上调的倍数在所有基因中位列第4。C3H10T1/2成骨诱导后上调倍数最高的Zbtb16基因区域也在成骨诱导后出现超级增强子。逆转录-实时定量PCR进一步证实了Lcn2的mRNA水平在成骨诱导后急剧升高(P0.001)。结论 Lcn2是间充质干细胞(MSCs)正常成骨分化所必须的,但在衰老时过度表达和分泌以自限性抑制MSCs的成骨分化。关键词:脂质运载蛋白2;老年性骨质疏松;间充质干细胞;成骨分化Abstract:Objective To explore the role of lipocalin
7、 2(Lcn2)in bone development and senile osteoporosis.Methods Chromatinimmunoprecipitation with H3K27AC and H3K9Me3 antibodies coupled with massively parallel sequencing(ChIP-Seq)wasperformed to analyze the changes in binding of modified histones at the Lcn2 gene locus in C3H10T1/2 mesenchymal stemcel
8、ls(MSCs)induced with osteogenic induction medium for 3 days.ITRAQ-MS/MS and ELISA were used to compare Lcn2protein expressions in the cancellous bone and the serum between 16-and 3-month-old male mice.The effect of treatment withrecombinant Lcn2 protein on osteogenic differentiation of C3H10T1/2 cel
9、ls was evaluated by detecting changes in ALPexpression,and Western blotting was performed to examine the changes in OSX and OCN expression.Results The expressionof Lcn2 protein in the cancellous bone and its serum levels were significantly higher in 16-month-old than in 3-month-old malemice(P0.01).I
10、n C3H10T1/2 cells,ALP expression level decreased significantly after treatment with recombinant Lcn2 protein(P0.05)accompanied by lowered protein expressions of OSX and OCN(P0.05).Analysis with ROSE software revealed asuper enhancer in the Lcn2 gene region of C3H10T1/2 cells after osteogenesis induc
11、tion.RNA-seq results confirmed that Lcn2was among the top 4 up-regulated genes in C3H10T1/2 cells following osteogenic induction,and a super enhancer was alsodetected in Zbtb16 gene,which showed the highest up-regulation after osteogenic induction.Real-time quantitative PCRfurther confirmed that the
12、 mRNA level of Lcn2 increased sharply in C3H10T1/2 cells after osteogenic induction(P0.001).Conclusion Lcn2 is essential for normal osteogenic differentiation of MSCs,but its overexpression and excessive secretion inaging induce self-limited inhibition of osteogenic differentiation of MSCs.Keywords:
13、lipocalin 2;senile osteoporosis;mesenchymal stem cells;osteogenic differentiation老年性骨质疏松(SOP)主要原因在于骨髓间充质干细胞(BMSC)成骨分化减少,导致成骨细胞介导的骨形成(骨合成代谢)严重减少,而目前临床药物主要作用于成骨细胞靶点的药物很少 1。甲状旁腺激素激动剂-特立帕太主要通过增强成骨细胞形成以及抑制成骨细收稿日期:2022-10-25基金项目:广东省自然科学基金(2020A1515011035);番禺区科技计划项目(2018-Z04-67)作者简介:陈梓锋,副主任医师,E-mail:通信作者:王
14、 婷,博士后,E-mail:J South Med Univ,2023,43(8):1339-1344doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2023.08.101339胞凋亡来起到抗骨质疏松的作用 2,但该药是高钙血症患者禁用 3,价格昂贵,长期使用会增加患骨肉瘤的风险并且会损害皮质骨结构,进而导致骨折风险的进一步增加 4。雷诺昔芬属于选择性雌激素受体调节剂,通过促进骨形成和抑制骨吸收来起到抗骨质疏松作用,但雷诺昔芬有增加中风和静脉血栓栓塞的风险 5。所以研究可以促进BMSC成骨分化的靶点对于改善骨质疏松的药物研发起着重要意义。脂质运载蛋白2(Lcn2)也称为中性粒细胞明
15、胶酶相关脂质运载蛋白,是一种25 000的分泌蛋白,可结合并转运小的疏水物质 6。Lcn2在成骨细胞和白色脂肪细胞有较高表达 7,并在免疫细胞,肝细胞和肾小管细胞表达,其表达在病理状态下上调 8。Lipocalin-2是急性和慢性肾脏疾病、心力衰竭和肥胖相关医学并发症的功能性生物标志物 9。成骨细胞中过表达Lcn2的转基因小鼠存在骨量减少 10,且小鼠颅骨成骨细胞在模拟微重力条件下成骨分化减弱,而此时在多种基因中Lcn2的上调最明显 11,表明微重力条件下Lcn2可能参与成骨分化的抑制。在模拟微重力条件下,小鼠成骨细胞中出现Lcn2基因的上调,而小鼠原代成骨细胞中过表达Lcn2则导致骨形成减低
16、 12。以上数据提示Lcn2在微重力条件下可能反过来抑制成骨分化,但在骨发育和老年性骨质疏松的作用尚不清楚。Lcn2分泌蛋白对MSC成骨分化能力的作用值得研究,可为靶向Lcn2治疗老年骨质疏松提供理论基础。1 材料和方法1.1 材料C3H/10T1/2(ATCC),MEM 培养基(BiologicalIndustries),血清(Biological Industries),ALP试剂盒(碧云天),Lcn2 RP(R&D),OSX抗体、OCN(abcam),-actin、二抗抗兔、二抗抗鼠(北京锐抗),Lcn2 RPELISA试剂盒(elabscience),Trizol(Takara),反转
17、录试剂盒(Takara),qPCR试剂盒(诺唯赞)。3月龄和16月龄雄性C57BL/6J小鼠购自广东斯嘉景达生物科技有限公司,饲养于SPF级动物房。本研究动物实验已通过论理委审核(L2018179)。1.2 方法1.2.1 细胞培养 C3H/10T1/2细胞系使用MEM培养基培养,添加10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺、1%丙酮酸钠以及1%双抗,在37、CO2浓度为5%的细胞培养箱内培养,2 d/次更换培养基。当细胞百分百融合以后,加入成骨诱导液:终浓度50 mol/L的维生素C,终浓度10 mmol/L的-磷酸甘油和0.1 mol/L终浓度地塞米松,成骨诱导7 d。对照组(con
18、trol)为不加入Lcn2 RP;实验组(Lcn2 RP)为在成骨诱导液中额外加入50、100、200、500ng/mL的Lcn2RP培养7d。1.2.2 碱性磷酸酶(ALP)染色 将C3H/10T1/2细胞接种于24孔板,细胞完全融合后进行成骨诱导7 d后按ALP显色试剂盒操作说明对细胞进行固定、清洗、染色、扫描并记录。每组实验重复3次。1.2.3 实时定量荧光PCR 用Trizol法按说明书操作提取细胞RNA,测定浓度后并反转录合成cDNA。PCR扩增反应参照诺唯赞试剂盒的说明书进行。Lcn2和内参基因-actin引物序列如下:Lcn2:Forward Primer:TGGCCCTGAGT
19、GTCATGTGReversePrimer:CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC-actin:Forward Primer:GGCTGTATTCCCCTCCATCGReversePrimer:CCAGTTGGTAACAATGCCATGT1.2.4 免疫印迹实验(Westem blot)将C3H/10T1/2细胞接种于24孔板,细胞完全融合后进行成骨诱导7 d后提取细胞总蛋白后进行Westem blot实验。蛋白上样,10%SDS-PAGE电泳分离后,转膜,5%BSA封闭液封闭1 h,一抗置于4 孵育过夜,洗膜3次,37 孵育二抗1 h,洗膜3次,化学发光显影。Image J软件分析电
20、泳条带灰度值,以-actin作为内参,得出蛋白相对表达水平。1.2.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)小鼠麻醉后心脏取血,离心机3000 r/min离心10 min,获取上清液即为小鼠血清。稀释小鼠血清在Lcn2的ELISA试剂盒浓度范围内。将Lcn2的ELISA试剂盒从4冰箱取出,平衡至室温。按说明书操作。酶标仪检测A值算出相应血清的Lcn2浓度。1.2.6 RNA测序 RNA样品收集、建库、测序参见课题组论文 13,GEO:GSE169224。1.2.7 染色质免疫沉淀(ChIP)测序及数据分析将C3H10T1/2 MSC细胞以前述成骨诱导液诱导3 d(OB3 d)或 不 作 处 理(co
21、ntrol),参 照 Cell SignalingTechnology(CST)试剂盒裂解细胞,收集细胞核提取染色质,以H3K27AC和 H3K9Me3抗体进行免疫沉淀。纯化的DNA委托诺禾致源公司进行建库和双末端测序。简要步骤:首先利用Bowtie2将所有reads匹配到小鼠基因组(mm10),而后以MACS2.0检测peak并以Diffbind比较差异。以Deeptools将bam文件转换成bw格式,而后以IGV进行可视化展示。超级增强子通过ROSE 14 进行定义和比较。1.2.8 统计学分析 实验数据采用Graphpad prism7统计软件进行统计学分析。结果以均数标准差表示,组间比
22、较采用两独立样本t检验。当P0.05时认为差异有统计学意义。2 结果2.1 老年骨质疏松小鼠的松质骨和血清中Lcn2的蛋白表达和分泌显著升高J South Med Univ,2023,43(8):1339-1344http:/www.j-1340老年性骨质疏松与氧化应激密切相关,本研究筛选了在16月龄雄鼠股骨远端中上调的氧化应激相关蛋白(图1A)。iTRAQ-MS/MS结果显示,16月龄的老年雄鼠的松质骨中Lcn2蛋白表达相对于3月龄雄鼠明显上调(P0.01,图1B)。与此对应,ELISA结果显示16月龄老年雄鼠血清中Lcn2含量比3月龄对照(control)雄鼠明显升高(P0.01,图1C)
23、。316Relative Lcn2 fold4.03.53.02.52.01.51.00.50*图1 老年鼠股骨远端松质骨中Lcn2蛋白表达增强致血清中分泌增多Fig.1 Increasedexpressionoflipocalin2(Lcn2)inthedistalfemoralcancellousboneofagedmicecausesanincreasedserumlevelof Lcn2.A:Up-regulated proteins in 16-month-old male mice analyzed with GO_BP functional annotation with Clu
24、sterprofiler,which identified 4 oxidative stress-related proteins,including Lcn2.B:Specific fold upregulation of Lcn2.C:Serum level of Lcn2inagedmicedetectedbyELISA(MeanSD).*P0.01.16 months vs 3 months_upregulated_GO_B)Serum level of Lcn2(pg/mL)300025002000150010005000*BCA2.2 Lcn2剂量依赖地抑制C3H/10T1/2的成
25、骨分化与未加Lcn2重组蛋白的对照组相比,ALP染色结果和定量结果显示加入50 ng/mL的Lcn2 RP未见明显差异,加入100、200、500 ng/mL浓度Lcn2 RP后ALP表达减弱且有统计学差异(P0.05,图2)。Fold changeControl50100200500Lcn2 RP(ng/mL)1.41.21.00.80.60.40.20ALP*Control Lcn2 RP-100 ng/mLControl Lcn2 RP-500 ng/mLControl Lcn2 RP-50 ng/mLControl Lcn2 RP-200 ng/mLALP staining C3H/1
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