柚皮苷通过抑制Kupffer细胞的焦亡改善脂多糖诱导的肝损伤.pdf
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1、2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 柚皮苷通过抑制Kupffer细胞的焦亡改善脂多糖诱导的肝损伤臧宾宾1,李华1,杨颖2,谢航1,徐晓婷1(1.河南省中医院 郑州 450002;2.郑州市中医院 郑州 450007)摘要:目的探究柚皮苷(naringin,Nar)在脂多糖(LPS)诱导的肝损伤中的作用及相关作用机制。方法60只C47BL/6野生型雄性小鼠随机分为4组(每组15只):对照组(C
2、ontrol),柚皮苷组(Nar),脂多糖模型组(lipopolysaccharide,LPS)与柚皮苷组处理的LPS模型组(Nar+LPS),其中Nar组与Nar+LPS组小鼠予以100 mgkg-1d-1的柚皮苷持续灌胃10天,而LPS与LPS+Nar组小鼠经腹注射5 mgkg-1 LPS进行肝损伤造模,6 h后脱颈处死各组小鼠;试剂盒检测各组小鼠外周血中谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspertate aminotransferase,AST)含量,ELISA 检测炎症因子白介素-6(interlukin-6,IL-6)、白介素-1(inte
3、rlukin-1,IL-1)与肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF-)的水平;取小鼠肝脏组织,苏木精-伊 红(hematoxylin-eosin,HE)与 脱 氧 核 糖 核 酸 末 端 转 移 酶 介 导 的 缺 口 末 端 标 记 法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling,TUNEL)观察各组小鼠肝组织病理改变与细胞焦亡水平,反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测肝组
4、织中IL-6、IL-1、TNF-的 mRNA 表达,试剂盒检测氧化应激标志物丙二醛(malondialdehyde,MDA)与谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平;体外培养小鼠Kupffer细胞,CCK-8筛选LPS与Nar的最佳作用浓度后,将细胞同样分为Control组、Nar组、LPS组与Nar+LPS组;ELSIA检测各组细胞上清液中IL-6、IL-1、TNF-的表达;试剂盒检测细胞中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、MDA与GSH水平;cleaved Caspase-1/TUNEL染色检测各组细胞的焦亡情况,Western blot检测细胞中焦
5、亡相关蛋白,核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3(nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1裂解片段(cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase-1,cleaved Caspase-1)、gasdermin D 的 N 端寡聚化(Gasdermin D N-terminal oligomerization,GSDMD-N)、IL-1的表达水平和核因子-B(nuclear factor kappa-B,NF-B)
6、的磷酸化水平(p-NF-B/NF-B)。结果与Control组相比,LPS组与Nar+LPS组的血清中ALT、AST与IL-6、IL-1、TNF-水平均显著增加(P0.05或P0.01),肝组织病理损伤加重,肝细胞焦亡率升高,细胞中IL-6、IL-1、TNF-的mRNAs水平与MDA的含量均显著升高(P0.05),而GSH明显降低(P0.05),但较LPS组相比,Nar+LPS组中除肝组织中GSH含量明显升高外,上述其他检测指标均明显降低(P0.05);体外细胞实验中筛选出100 ngmL-1的LPS与200 molL-1的Nar为最佳作用浓度;与Control组Kupffer细胞相比,LPS
7、组与LPS+Nar组的IL-6、IL-1、TNF-与MDA、LDH含量和细胞焦亡水平及焦亡相关蛋白NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD-N、IL-1的表达均明显升高(P0.05),NF-B的磷酸化水平(p-NF-B/NF-B)亦显著升高,而GSH含量明显降低(P0.05),但与LPS组相比,LPS+Nar组除GSH明显升高外,其他检测指标均显著降低(P0.05)。结论柚皮苷可在体内外降低炎症反应与氧化应激来减轻LPS诱导的肝损伤与功能障碍,这可能与其能通过NF-B途径抑制Kupffer细胞焦亡的机制相关。收稿日期:2022-02-16 修回日期:2022-05-17 河南
8、省教育厅河南省高等学校重点科研项目(21A320009):以脓毒症为例评估中医药在重症医学质量控制体系中的作用,负责人:李华。通讯作者:李华,副主任医师,硕士生导师,主要研究方向:中西医结合治疗急危重症。1122 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与肝肠疾病研究关键词:柚皮苷 脂多糖诱导的肝损伤 炎症反应 氧化应激 细胞焦亡doi:10.11842/wst.20220216011 中图分类号:R285.5 文献
9、标识码:A脓毒症通常是指机体对调节微生物感染的能力失调,从而导致的全身炎症反应综合征1。近年来,尽管随着抗生素的广泛应用与新疗法的不断发展,但脓毒症患者的临床死亡率依然较高1-2。肝脏作为人体最大的腺体器官,在脓毒症的代谢与免疫稳态维持中发挥着关键作用。同时,肝免疫细胞(如Kupffer细胞)可释放大量导致肝损伤的促炎介质,有证据表明,急性肝损伤和肝功能障碍可直接导致脓毒症患者的病情恶化与死亡3-4。然而,关于肝损伤的研究并不多见。因此,积极研究肝损伤进展的分子机制并寻求新的治疗药物对脓毒症的临床预后至关重要。柚皮苷(naringin,Nar)是一种天然黄酮类化合物,其能从芸香类植物如葡萄柚、
10、橙子和柑橘中提取5。既往研究证实柚皮苷具有抗炎、抗氧化、抗焦亡等作用,且能在体内外的多种疾病模型中改善器官与细胞的损伤5-7。最近报道表明,柚皮苷可广泛应用于脓毒症中,如研究发现,柚皮苷可通过核因子-B(nuclear factor-B,NF-B)通路下调促炎因子的释放来减轻脓毒症诱导的肺损伤与肠功能障碍,同时柚皮苷还能通过激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号通路抑制心肌细胞中 NF-B 的磷酸化和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthas
11、e,iNOS)的活性,以减轻脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的脓毒症心肌功能障碍8-10。这提示柚皮苷可能是一种具有前景的治疗脓毒症器官损伤的候选药物。然而,柚皮苷对脓毒症肝损伤是否具有保护作用尚无相关研究报道。因此,本研究旨在探究柚皮苷对LPS诱导的肝损伤的作用及其可能的分子机制,以期为肝损伤的治疗提供新的思路与策略。1 实验材料与方法 1.1实验动物与主要试剂SPF级C47BL/6野生型雄性小鼠(周龄6-8周,体重22-25 g)60只购自河南省实验动物中心;LDH释放检测试剂盒(江苏碧云天生物技术有限公司);CCK-8试剂(日本同仁化学研究所);柚皮苷,4-6-
12、二氨基-2-苯基吲哚(4-6-diamino-2-phenylindole,DAPI)试剂、Hoechst33342与PI试剂(纯度95%,美国Sigma公司);TRIzol试剂、反转录试剂盒、SYBR Ex Taq试剂盒(日本TaKaRa公司);丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);白介素-6(IL-6)、白介素-1(IL-1)与肿瘤坏死因子-(TNF-)的ELISA检测试剂盒、2,7-二氯氢荧光素二乙酸酯荧光探针(fluorescent probe of 2,7-dichlorohydrofluorescein diaceta
13、te,DCFH-DA)(江苏碧云天生物技术有限公司);双茚二酮酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白测定试剂盒、苏木精-伊红(HE)染色试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(北京索莱宝生物科技公司);TdT介导的dUTP切口末端标记的TUNEL染色试剂盒(瑞典Roche公司);兔抗小鼠GSDMD-N、cleaved Caspase-1抗体(美国Abcam公司);异硫氰酸荧光素(fluoresceinIsothiocyanate,FITC)标记的山羊抗兔二抗(武汉赛维尔生物科技有限公司);兔抗小鼠 NLRP3、IL-1、NF-B、p-NF-B、GAPDH(美国Cell Sig
14、aling公司);RT-PCR引物由上海吉玛生物制药有限公司设计与合成。1.2方法1.2.1小鼠肝损伤模型的建立与分组所有小鼠均饲养于 SPF 级实验动物房内,温度21-24,湿度40%-60%,自由摄食水,12 h/12 h光/暗循环。造模前所有小鼠适应性饲养1周。按随机数字表法将60只小鼠随机分为4组(每组15只),分别为:对照组(Control),柚皮苷组(Nar),LPS组(LPS)与柚皮苷组处理的 LPS 造模组(Nar+LPS)。参考文献方法11-12,对 LPS 组与 Control 小鼠经腹注射 5 mgkg-1 LPS或等体积的生理盐水,而Nar+LPS组小鼠在LPS造模前1
15、0天予以100 mgkg-1d-1的柚皮苷灌胃,第10天腹腔注射5 mgkg-1的LPS;Nar组小鼠仅予以100 mgkg-1d-1的柚皮苷持续灌胃10天。造模6 h后,脱颈处死各组小鼠进行后续相关实验。本实验经我院伦理委员会批准,严格遵守实验动物使用的3R原则。1.2.2苏木精-伊红(HE)与TUNEL染色取各组小鼠肝组织,4%甲醛固定24 h后,梯度乙醇脱水,石蜡包埋,切片至5 m后使用试剂盒进行HE染色,光学显微镜下观察炎症细胞浸润与肝细胞形1123 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-Wor
16、ld Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 态;使用TUNEL试剂盒检测各组小鼠肝组织细胞的焦亡情况,具体方法如下:取4%甲醛固定后的肝组织,石蜡包埋切片至5 m后,常规脱蜡后,置于蛋白酶K溶液孵中于37下孵育25 min,随后加入50 molL-1的 TUNEL 试剂于避光孵育 1 h,0.3%双氧水溶液于37下进行封闭内源性 POD 30 min,DAB试剂显色,苏木精复染,最后在光学显微镜下观察TUNEL阳性细胞数。其中TUNEL染色下焦亡细胞核为棕黄色,正常细胞核为蓝色或蓝紫色。每个样本随机观察5个阳性视野,计算TUNEL阳
17、性细胞数。TUNEL阳性细胞率=TUNEL阳性细胞/细胞总数100%.1.2.3细胞培养与CCK-8实验小鼠Kupffer细胞购自美国ATCC细胞库;常规复苏细胞后,使用含有10%FBS的DMEM培养基,并在含37,5%CO2的培养箱中进行培养。取生长状态良好的Kupffer细胞,按细胞密度为5103个/孔接种至96孔板中,于37,5%CO2的培养箱中进行培养12 h待细胞贴壁后,予以不同浓度的(0、10、50、100、200、500、1000 ngmL-1)的LPS进行处理细胞24 h后,加入10 L CCK-8试剂,培养箱继续孵育2 h后,在酶标仪450 nm波长处检测各LPS浓度处理后的
18、每孔细胞吸光度值。随后选择100 ngmL-1与不同浓度的Nar(0、100、200、500 molL-1)继续处理Kupffer细胞24 h后,按前述方法进行检测每孔吸光度值。上述各个浓度设置5个复孔,实验单独重复3次。1.2.4细胞的处理与分组根据CCK-8实验结果,取生长状态良好的Kupffer细胞并将其分为四组,分别为:正常培养的Control组,使用100 ngmL-1的LPS处理的LPS组,使用200 molL-1的Nar处理Nar组和预先用200 molL-1的Nar处理2 h 后在应用 100 ngmL-1的 LPS 处理的 Nar+LPS 组。各组 Kupffer细胞置于 3
19、7,5%CO2的培养箱中培养24 h后用于后续相关实验。1.2.5炎症因子 IL-6、IL-1、TNF-与氧化应激标志物MDA、GSH的检测使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠血清与Kupffer细胞上清液中炎症因子IL-6、IL-1、TNF-的表达,具体操作参考ELISA试剂盒说明书方法进行;小鼠肝组织与Kupffer细胞中氧化应激标志物MDA与GSH的检测按照商品化试剂盒使用说明书进行。上述实验均单独重复3次。1.2.6细胞中LDH释放检测与活性氧(ROS)检测LDH释放检测:取生长状态良好的Kupffer细胞,按3105个/孔接种至12孔板中,过夜培养后,分组处理细胞,继续培养24
20、 h后,取各组细胞上清液,按照试剂盒使用说明书方法在酶标仪440 nm处检测各组细胞的吸光度值。活性氧(ROS)检测:取对数生长期各组细胞,按2105接种至12孔板中,待细胞贴壁后按方法1.2.5进行分组处理,37,5%CO2的培养箱中培养24 h后,弃去原培养液,每孔加入终浓度为10 molL-1的DCFH-DA试剂,37下避光孵育30 min后,DMEM充分洗涤细胞后,应用荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光强度,以平均荧光强度(mean fluorescence intensity)值代表细胞内ROS水平。上述实验均单独进行3次。1.2.7cleaved Caspase-1/TUNEL染色检测
21、细胞焦亡取各组Kupffer细胞,4%多聚甲醛固定后,Triton X-100进行破膜,5%牛血清白蛋白进行抗体封闭,加入cleaved Caspase-1抗体(1 100),4下孵育过夜,次日加入FITC标记的荧光二抗(1 200),室温下孵育2 h后,PBS洗涤后加入TUNEL试剂,37下孵育1 h后,再使用DAPI试剂进行染色。充分洗涤玻片后,荧光显微镜下随机选取 5 个阳性视野,计算分析 cleaved Caspase-1与TUNEL共染色细胞百分率。实验单独重复3次。1.2.8RT-PCR利用 TRIzol 试剂提取待测细胞中 RNA,经定性与浓度检测后,按反转录试剂盒说明书方法进行
22、反转录成 cDNA 后,并以其为模板进行 RT-PCR。RT-PCR 的反应体系与温度按 SYBR Ex Taq试剂盒建议的条件设置。RT-PCR 的引物序列为:IL-6-F:5-AGGAGTGGCTAAGGACCAAGACC-3,IL-6-R:5-TGCCGAGTAGACCTCAAGTGACC-3;IL-1-F:5-CAGCAGCACATCAACAAGAG-3,IL-1-R:5-AGCAGGTTATCATCATCATCC-3;TNF-F:5-GCATGATCCGAGATGTGGAACTGG-3,TNF-R:5-CGCCACGAGCAGGAATGAGAAG-3;GAPDH-F:5-GGGTGT
23、GAACCACGAGAAAT-3,GAPDH-R:5-CCACAGTCTTCTGAGTGGCA-3。以 GAPDH 为 内参,采用2-ct法分析目的基因的mRNA水平。实验单独重复3次。1.2.9Western blot实验取各组待测细胞,使用含蛋白酶抑制剂的细胞裂1124 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与肝肠疾病研究解液进行提取细胞中总蛋白,BCA法进行蛋白定量;SDS-PAGE 凝胶电泳进行分离蛋白条带
24、后,转移至PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温下孵育1 h以封闭抗体阻断非特异性结合,随后加入一抗:GSDMD-N(1 800)、cleaved Caspase-1(1 1000)、NLRP3(1 800)、IL-1(1 500)、NF-B(1 1000)、p-NF-B(1 800)与GAPDH(1 1000),4下孵育过夜,次日充分洗涤后,加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1 5000),室温下孵育2 h,最后加入增强型化学发光液显示,并用Image J软件进行定量分析。实验单独重复3次。1.3统计学分析采用 GraphPad Prism 5.0 软件进行统计学分析。所有数据以均值标准差(x s)进行
25、表示,采用单因素方差分析和LSD-t事后检验进行多组间差异的分析;以P0.05认为差异有统计学意义。2 结果2.1柚皮苷改善LPS诱导的小鼠肝损伤ELISA检测血清ALT与AST的含量结果显示,与Control 组相比,LPS 组与 Nar+LPS 组的血清 ALT 与AST 含量均显著增加(P0.05或 P0.05),而与 LPS 组相比,Nar+LPS 组的ALT、AST 均明显降低(P0.05);HE 染色结果显示,Control组小鼠的肝组织呈正常形态,未见明显病理改变;LPS组肝细胞排列紊乱,肝小叶结构异常,周围炎性细胞大量浸润,Nar+LPS组小鼠肝细胞轻度损伤,肝小叶结构较为清晰
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