燕窝中结合唾液酸调节5种益生菌生长以及孕妇肠道菌群组成的研究.pdf
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1、燕窝中结合睡液酸调节5种益生菌生长以及孕妇肠道菌群组成的研究鲁佩涵,吴剑荣1*,柳训才,华玉蓉3,詹晓北,高敏杰,张洪涛研究报告D0I:10.13995/ki.11-1802/ts.034349引用格式:鲁佩涵,吴剑荣,柳训才,等.燕窝中结合唾液酸调节5种益生菌生长以及孕妇肠道菌群组成的研究 J.食品与发酵工业,2 0 2 3,49(17):53-6 1.LU Peihan,WU Jianrong,LIU Xuncai,et al.Regulation of bacteria growth of five probiotics andintestinal flora of pregnant w
2、omen by bound sialic acid of edible bird s nestJ.Food and Fermentation Industries,2023,49(17):53-61.1(糖化学与生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,2 1412 2)2(厦门燕之屋丝浓食品有限公司燕窝研究院,福建厦门,36 10 0 0)3(江南大学附属医院,江苏无锡,2 1412 2)摘要膳食动物源黏蛋白存在结合态睡液酸聚糖,可能对人体营养健康产生影响。该文以一种富含唾液酸的黏蛋白一燕窝(edible birds nest,EBN)为研究对象,通过酸处理切除燕窝糖蛋白末端唾液酸(a
3、cidolysisbirdsnest,A BN),分别进行体外模拟消化,比较酸处理前后的燕窝及睡液酸单体在抗氧化活性方面的差异,以及对不同益生菌和孕妇粪菌在体外发酵的影响。结果表明,EBN比ABN和唾液酸具有更好的抗氧化活性。EBN以及唾液酸可不同程度改善乳杆菌和双歧杆菌菌株的生长,并增加短链脂肪酸的生成。同时,EBN可以显著促进阿克曼黏细菌的生长。在体外进行的健康女性和孕晚期孕妇粪菌发酵中,EBN在2 4h内可显著增加乙酸、丙酸和丁酸的产量,其中丙酸的增加最为显著。同时,EBN还能够降低大肠杆菌-志贺氏菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等潜在致病菌的相对丰度,并增加潜在益生菌(如拟杆菌属、粪杆菌属
4、和粪球菌属)的相对丰度。EBN在降低致病菌丰度和增加益生菌丰度具有比ABN更加显著的效果。因此,EBN中结合了唾液酸的完整性对其生物学功能起重要作用。关键词燕窝;睡液酸;益生菌;肠道菌群;短链脂肪酸唾液酸是一类神经氨酸衍生物的总称,广泛存在于哺乳动物组织、乳汁和卵类中,主要以低聚糖、糖蛋白或糖脂的形式存在 。其中N-乙酰神经氨酸(Ne u 5A c)和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)是最常见的存在形式,主要有抗炎、协助神经发育和抑制病菌等作用 2 。另外,人类生存所需的动物源膳食如乳品、禽蛋和肉类等含有丰富的唾液酸,这类唾液酸多以结合态的形式存在,主要通过2-6/2-3糖苷键连接在半乳糖/半
5、乳糖胺上,如燕窝糖蛋白、卵黏蛋白、酪蛋白糖巨肽、3-唾液酸乳糖等 3燕窝(ediblebirdsnest,EBN)是金丝燕及多种同属燕类利用唾液分泌物建造的巢穴,经过处理后可以作为食品。中医理论认为燕窝具有补中益气、人胃补脾和化痰止咳等功能 4。许多研究表明燕窝具有促进大脑发育、改善记忆 5 和抗病毒 6 等功效。燕窝的主要成分为富含唾液酸的黏蛋白,唾液酸含量占干重的7%15%,不同产地来源的燕窝唾液酸含量差别较大 7 C第一作者:硕士研究生(吴剑荣副教授为通信作者,E-mail:k i n o w u j i a n g n a n.e d u.c n)基金项目:国家重点研发计划项目(2 0
6、 2 1YFC2101402)收稿日期:2 0 2 2-11-18,改回日期:2 0 2 2-12-2 3女性在妊娠期会通过自身的代谢对胎儿的生长发育产生影响。孕妇血液中的唾液酸会随着妊娠阶段的不同有所改变,研究表明母体会合成唾液酸并通过胎盘提供给7 9 个月的胎儿,以供其生长发育所需。BRIESE等发现母体是胎儿睡液酸的主要来源,对胎儿在妊娠晚期的发育起重要作用。研究表明,摄入外源唾液酸可以提高妊娠期女性血液中唾液酸含量 10 ,而燕窝经过消化后糖链结构的改变可能对人类,特别是妊娠期女性的肠道健康产生影响。肠道微生物对宿主健康至关重要 。肠道微生物可以发酵糖类物质产生短链脂肪酸(shortc
7、hainfattyacids,SCFA s),主要包括乙酸、丙酸和丁酸,它们对机体生理代谢的调节起重要作用 12 。益生菌是指对宿主有益并有利于肠内菌群生态平衡的活性微生物,在改善肠道环境,参与免疫调节等方面具有潜在的应用价值 13。本研究以富含唾液酸的燕窝为研究对象,通过酸处理切除燕窝糖蛋白末端唾液酸(a c i d o l y s i s b i r d s n e s t,A BN)为对照,分别比较EBN、2023年第49 卷第17 期(总第48 5期)53食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIESABN和Neu5Ac的功能,探究燕窝糖蛋白末端唾液酸完整性对
8、其抗氧化活性的影响,以及对益生菌生长和孕妇肠道菌群调节的作用。1材料与方法1.1菌株与培养基短双歧杆菌FWX346、动物双歧杆菌ZJTZ1M2、干酪乳杆菌FJSSZ4L6、鼠李糖乳杆菌FFJLY7L1、嗜黏蛋白阿克曼黏细菌(Akkermansiamuciniphila),江南大学(中国无锡)食品微生物菌种保藏中心;燕窝样品,厦门燕之屋生物工程有限公司,将即食的炖煮燕窝用去离子水冲洗过滤3次,收集沉淀冻干制成EBN冻干粉备用。EBN脱唾液酸的方法参照文献14,略作修改。将冻干得到的EBN粉末以1mol/L盐酸在37 下处理12 h,再次清洗过滤,收集沉淀,得到ABN作为对照。MRS培养基(g/L
9、):胰蛋白陈10、酵母提取物5、葡萄糖3、CH,C00ONa5、K,H PO 42、M n SO 40.2、M g SO 40.2、C a C l,0.45、L-半胱氨酸0.5、柠檬酸铵2 和1mL吐温-8 0,pH6.5。基础营养培养基(g/L):蛋白陈2、酵母提取物2、Na CI 0.1、K H,PO 4 0.0 4、K,H PO 4 0.0 4、Na H CO,2、胆盐0.5、L-半胱氨酸盐酸盐0.5、MgS040.01、Ca Cl 20.025、维生素K0.002、氯化血红素0.0 2 5、2 mL吐温-8 0,pH 6.5。1.2体外模拟消化1.2.1模拟睡液消化将 KCl(1.12
10、6 g/L)、Na H CO,(1.143 g/L)、Na Cl(0.12 g/L)、C a C l,(0.16 7 g/L)和-淀粉酶(150 U/mL)溶解于去离子水中制备唾液消化液。然后,以1:1体积比例分别与EBN、A BN溶液在EP管中混合,在80r/min、37 水浴振荡。消化15min后,在10 0 水中煮沸10 min灭酶。1.2.2模拟胃液消化将人工胃液与模拟唾液消化液按1:1体积比混合,使用0.1mol/L盐酸将所得溶液的pH值调节至2.0,在8 0 r/min、37 水浴振荡。消化4h后,在100的水中煮沸10 min灭酶。1.2.3模拟小肠液消化将上述得到的胃消化液用1
11、mol/L的NaHCO3溶液将pH值调为7.0,再向其中加人等体积的人工小肠液,8 0 r/min、37 水浴振荡。消化6 h后,在542023 Vol.49 No.17(Total 485)100的水中煮沸10 min灭酶,得到最终的消化液。1.3睡液酸的检测方法参考文献 15 的方法使用间苯二酚-盐酸法测定唾液酸的含量。1.4抗氧化活性的检测方法参考文献16 中的方法测定DPPH自由基清除率、OH清除率、O,清除率、还原力。1.5双歧杆菌和乳杆菌的培养方法在厌氧培养箱进行单个细菌的体外培养。在MRS培养基中激活菌株。将EBN和ABN作为碳源以5g/L的终质量浓度、Neu5Ac和菊粉作为对照
12、以0.5g/L的终质量浓度取代MRS培养基中的葡萄糖。不含葡萄糖的MRS作为空白。每组进行3个平行,以10%(体积分数)的接种量于37 培养2 4h,使用紫外分光光度计测量光密度(OD.o0m)。1.6SCFAs的气相色谱检测方法使用GC进行测定,HP-INNOWAX色谱柱,Agi-lent-7890A气相色谱仪。取1mL离心后的发酵上清液,添加终浓度为1mmol/L的2-甲基丁酸作为内标,再向其中添加2 50 L浓盐酸和1mL乙醚,混匀。收集有机层,使用0.2 2 m的有机滤膜过滤杂质后备用。以1:2 0 的分流比将5L样品注入仪器,进样器温度2 2 0,检测器温度2 50。使用N,作为载气
13、,流速为1.5mL/min。计算SCFAs的含量。1.7志愿者和粪便的收集使用无菌的粪便收集管从3名适龄未妊娠健康女性(食用中国传统膳食,年龄2 0 30 岁)志愿者收集健康女性的粪便样本,从无锡市江南大学附属医院妇产科的6 名孕晚期孕妇志愿者收集孕晚期孕妇的粪便样本(江南大学附属医院医学伦理委员会的批准号:LS2021066),并且收集了所有志愿者的书面知情同意书。主要收集的信息包括年龄和孕周(表1),按照年龄差距分为2 组,组I的年龄较小,组的年龄较高。参与者在粪便样本捐赠前至少2个月没有服用益生菌或益生元,并且没有胃肠道疾病史。收集的粪便样品立即保存在厌氧培养袋中,置于冰盒,在6 h内送
14、到实验室作下一步处理。1.8健康女性和不同年龄段孕晚期孕妇粪便微生物的体外发酵将EBN和ABN消化液作为碳源以5g/L的终质量浓度、唾液酸单体(Neu5Ac)作为对照以0.5g/L的终质量浓度添加到基础营养培养基中。将每组3个人的粪便样本等量混合,并用无菌的生理盐水梯研究报告度稀释,无菌的4层纱布过滤。将粪便稀释液以(V e r s io n 1.9.1)计算多样性指数等。10%的体积分数转接到培养基中。基础营养培养基1.10丝统计分析作为空白组,每组3个平行,37 培养2 4h。分别收所有样品均设置3个平行,使用SPSS25.0统计集0 h和2 4h的发酵液样品。软件进行分析。数据以平均值标
15、准差表示。使用表1粪便捐赠者的基本信息单因素方差分析数据,在PEBNABNNeu5Ac。对3组样品的还原力进行测定,从低浓度到高浓度,与维生素C相比,3组样品均未表现出明显还原力,Neu5Ac的还原力表现略优于EBN和ABN。本研究验证了EBN具有良好的抗氧化活性,而ABN的抗氧化活性相较于有完整糖链的EBN有所降低,也证明了EBN糖蛋白末端唾液酸的完整性对其生物活性有重要意义。2.2燕燕窝中结合睡液酸对双歧杆菌和乳杆菌生长的影响双歧杆菌和乳杆菌是受到广泛认可的益生菌,有益于宿主健康。例如双歧杆菌在免疫增强、改善胃肠道功能和抵抗病原菌等方面发挥着关键的作用18 。我们进一步研究EBN、A BN
16、和Neu5Ac对双歧杆菌和乳杆菌生长的影响,结果如图2 所示。在发酵2 4ha1.0ra0.8b00.40.200.60.4b0.20Fig.2 Effect of bound sialic acid of EBN on the growth of Bifidobacterium and LactobacillusSCFAs对人体健康起重要作用,如乙酸是结肠上皮细胞的能量来源,丙酸在降低脂肪的合成及血清胆固醇水平方面具有关键作用,丁酸可以通过刺激抗菌肽的生成改善肠道屏障2 1。检测在发酵2 4h内积累SCFAs的浓度,如图3所示。4株益生菌在体外发酵EBN过程中分别产生(8 3.2 2 16.
17、46)、(10 6.7 6 6.09)、(7 3.0 9 1.7 8)、(10 1.4 4.58)m m o l/L 的乙酸,显著高于其他组(P0.05),2 株乳杆菌产生的丙酸总体高于双歧杆菌。短双歧杆菌、动物双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌在体外发酵EBN过程中产生的丁酸后,EBN和Neu5Ac显著增加短双歧杆菌的生物量分别至0.9 7 0.0 3和0.8 50.0 3,显著高于ABN和菊粉组。这可能是由于双歧杆菌的生长与代谢来自多种多聚寡糖和糖蛋白的复杂碳水化合物的能力有关。CHEN等19 发现在人肠道菌群体外发酵过程中添加唾液酸化免疫球蛋白G能够显著促进双歧杆菌的生长。短双歧杆菌具有去糖基化糖蛋
18、白和利用聚糖作为碳源的能力,还可以通过胞外唾液酸酶从低聚糖中释放唾液酸2 0 。因此,脱去唾液酸的ABN无法像EBN那样显著改善短双歧杆菌的生长。EBN和ABN显著增加了干酪乳杆菌和动物双歧杆菌的生物量,空白、菊粉和Neu5Ac组之间的差异不大。可能是由于这2 种益生菌可以利用燕窝中的其他营养成分导致的。鼠李糖乳杆菌在添加了菊粉的培养基中生长最好,EBN、A BN和Neu5Ac组则没有显著差异。b 2.0 1.5Fbb空白EBNABN菊粉Neu5Acaa空白EBNABN菊粉Neu5Aca-短双歧杆菌;b-动物双歧杆菌;c-干酪乳杆菌;d-鼠李糖乳杆菌图2 燕窝中结合唾液酸对双歧杆菌和乳杆菌生物
19、量的影响注:图中不同小写字母表示差异显著(P0.05),下同。auu009o1.00.50空白EBNABN菊粉Neu5Acd1.5 abbc1.0uu009bbbed0.50空白EBNABN菊粉Neu5Ac浓度显著高于其他组(P0.05)。可以看出,燕窝能够促进双歧杆菌和乳杆菌的生长,糖链结构完整的EBN可以显著促进能够利用唾液酸的益生菌生长(如短双歧杆菌)并增加益生菌产生有机酸的量以改善肠道环境,而脱去唾液酸的ABN则无此效果。2.3燕窝中结合唾液酸对阿克曼黏细菌生长的影响嗜黏蛋白阿克曼黏细菌(Akkermansia muciniphi-la)被认为是一种很有应用潜力的候选益生菌,具有多种对
20、宿主有益的活性功能。它在体内的丰度与结肠炎、I型糖尿病2 2 、肥胖、动脉粥样硬化2 3 等诸多CdC562023 Vol.49 No.17(Total 485)研究报告口息a150(T/ouul)/湿Z10050EBNABN豆菊粉aNeu5AcabbbbbcbCb2.0(T/louu)/组1.5baabEBNABN三菊粉Neu5Ac1.0a0.5C2.0(1/ouu)/l.L1.51.0bCTEBNABN菊粉Neu5Acabbb0.5bbbbabab00L.rhamnosusFFILY7LIa-乙酸;b-丙酸;c-丁酸图3燕窝中结合唾液酸对双歧杆菌和乳杆菌产SCFAs的影响Fig.3 Eff
21、ect of bound sialic acid of EBN on the production of SCFAs by Bifidobacterium and Lactobacillus疾病呈负相关,可以改善脂代谢、调节免疫、改善肠道屏障2 4 等。如图4-a所示,在体外发酵过程中,EBN和菊粉都可以很好的促进A.muciniphila 的生长,在24h内细菌生物量的生长显著高于ABN和Neu5Ac组(P0.05)。检测A.muciniphila在发酵2 4h积累SCFAs的浓度,在体外发酵过程中EBN组的乙酸浓度在2 4h内显著高于ABN组(P0.05),丙酸和丁a1.00.810.6o
22、0.40.20C1.5(T/louu)/1.0酸产量较少且差别不大。A.muciniphila 的特征是高度适应在黏蛋白降解物中生存,EBN中丰富的唾液酸黏蛋白含量也印证了这一点,但是破坏了末端唾液酸的ABN则没有显著促进A.muciniphila生长的能力,据此我们推测,EBN末端唾液酸是发挥其生物活性的重要结构组成。b100aab空白EBNABN菊粉Neu5Ac80(T/ouul)/Zbd1.5(T/louu)/组L1.0a60C40200空白EBNABN菊粉Neu5Acaabcbab0.50Fig.4 Effect of bound sialic acid of EBN on the g
23、rowth and the production of SCFAs of Bifidobacterium and Lactobacillus2.4#燕窝中结合睡液酸对健康女性和孕妇肠道菌群的影响2.4.1燕窝中结合睡液酸对粪便微生物有机酸生成的影响肠道微生物在结肠发酵常常伴随着SCFAs的产生,这些有机酸具有抑制有害病原体生长、调节上皮屏障功能、降低结肠pH值和预防结直肠癌等作a空白EBNABN菊粉Neu5Aca-细菌生物量;b-乙酸;c-丙酸;d-丁酸图4燕窝中结合唾液酸对阿克曼黏细菌生物量和产SCFAs的影响a0.50空白EBNABN菊粉Neu5Ac用2 5。用健康女性和孕妇的粪菌发酵EB
24、N、A BN和Neu5Ac,SCFAs生成结果如图5所示。与健康女性组相比,EBN在孕妇组产生的乙酸比其他组的差异更加显著(P 4),如图7 所示。a一ABN一空白EBNNeu5Ac_Enterobecteric_BacteroidiaP_Bacteroidotao.Bacteroidalesf_Bacteroidacac_Baceroidesc_Bacillio_Lactobacilalesf_PrevotellaceaegPrerotella_o_Enterobacteralesf_Enterobacteriaceaec_Gammaproteobacteriap_Proteobacteri
25、agKlebsiellas_Klebsiella_pneumoniacc_Clostridiap_FirmicutesoLachnospiralesfLachnospiraceae_Oseillospiralesf_Ruminococcaceaeg_FaecalibacteriumgAgathobacters_Faealibacterlum_prausnisis_Bacteroides_mlgatus&_RoseburiagCoprococcusgLnchnospirao_BurkholderialesFig.7 LEfSe analysis of microbiota communities
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