一种筛选无青蟹呼肠孤病毒(MCRV)种蟹的荧光定量RT-PCR检测方法及其应用.pdf
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1、青蟹呼肠孤病毒(mud crab reovirus,MCRV)是养殖拟穴青蟹(Scylla paramamosain)致死率最高的病原之一,青蟹种蟹及其幼体携带该病原对青蟹养殖产业的高质量发展造成了重大威胁。为从源头切断该病原的感染和传播,本研究研发了一种筛选无 MCRV 种蟹的荧光定量检测方法。为最大限度地提高检测灵敏性,首先,本研究分析 MCRV 在感染青蟹主要组织中的含量,发现血淋巴中病毒载量最高;随后,分析该病毒的 13 个预测基因在血淋巴中的表达水平,发现病毒 VP11基因相对表达量最高;最后,基于 VP11 基因序列保守区设计特异引物,建立了一种 SYBR Green quanti
2、tative reverse-transcription PCR(qRT-PCR)检测方法,该方法可精确检测的病毒下限为50 copies/反应。该检测方法具有组织和靶标基因选择优势,灵敏性显著高于早期报道的其他检测方法。使用该方法对含有 5 种常见甲壳动物病原的样品进行检测,均无特异性扩增。抽取微量血淋巴(大约 50 L/只)提取 RNA,随后使用该检测方法对 22 只种蟹和 20 只市售青蟹进行 MCRV 检测,阳性率分别 54.44%和 85.00%。此外,利用该方法进一步分析了 MCRV 在较低温度下(21)在青蟹体内的增殖情况,发现病毒感染早期 MCRV 呈指数方式增殖,随后进入平台
3、期,实验周期内无青蟹死亡。总之,本研究建立了一种灵敏性高、实用性强的 MCRV 检测方法,既可用于微创条件下无 MCRV 种蟹筛选,也能满足病原感染相关研究的需要。关键词 MCRV;检测方法;青蟹种蟹;定量 RT-PCR 中图分类号 S945 文献标识码 A 文章编号 2095-9869(2023)05-0172-10 拟穴青蟹(Scylla paramamosain)俗称青蟹,是我国重要的海水养殖品种。病害是青蟹健康养殖主要的威胁(蔡小辉等,2013;郑天伦,2014),青蟹呼肠孤病毒(mud crab reovirus,MCRV)是养殖青蟹的主要病原(Weng et al,2007)。MC
4、RV 是一种双链无囊膜 RNA病毒,基因组包含 12 个节段,预测可编码 13 个开放阅读框(ORF)(Chen et al,2011、2012)。早期研究显示,该病毒感染可导致锯缘青蟹(Scylla serrata)近 100%的死亡率(Weng et al,2007)。近年来的研究显示,该病毒感染非常普遍,几乎所有青蟹养殖池塘都可以检第 5 期 储 旭等:一种筛选无青蟹呼肠孤病毒(MCRV)种蟹的荧光定量 RT-PCR 检测方法及其应用 173 测到该病毒(申亚阳等,2017)。因此,筛选无 MCRV种蟹,从繁育阶段净化病原、获取无 MCRV 病原苗种(SPF)势在必行。目前,普通 RT-
5、PCR、RT-LAMP、巢式 RT-PCR和 荧 光 定 量 PCR(qRT-PCR)检 测 方 法 已 应 用 于MCRV 检测(熊娟,2011;张迪等,2013a、b)。上述检测方法引物设计主要是基于VP1基因(病毒RNA聚合酶基因),考虑到该基因表达水平不高,限制了检测方法的灵敏性,需要挑选表达水平更高的靶标基因设计检测引物,提高检测方法的灵敏性。此外,目前的检测方法通常取青蟹鳃组织进行病毒检测,这种杀死青蟹进行病毒检测的方法显然不适用于良种场无毒种蟹筛选。因此,有必要研发对青蟹损伤小的取样方法。qRT-PCR 技术具有灵敏度高、特异性强、准确可靠等特点,已广泛应用于病原定量检测等(Le
6、e et al,2006)。与 TaqMAN 探针法、分子信标法和 LUX 引物法相比(Rekhviashvili et al,2006;Liang et al,2019;宋增磊等,2019;桑松文等,2021),基于 SYBR Green 的qRT-PCR 检测方法引物设计简单、费用低且具有独特的熔解曲线分析程序,使其成为当前应用最为广泛的病原检测技术之一(李新苍等,2012)。本研究将基于表达量更高的病毒基因设计引物,并借助 SYBR Green qRT-PCR 检测方法的灵敏性和实用性,研发对青蟹创伤小的 MCRV 检测方法,满足青蟹种蟹 MCRV 净化需要。1 材料与方法 1.1 实验
7、动物和病毒核酸样品 实验用健康青蟹来自上海崇明某养殖场,将2021 年 5 月采自海南的 22 只种蟹和 2021 年 9 月采自浙江的 20 只商品青蟹用于病原检测。MCRV 为本实验室于2020年从浙江某养殖场分离鉴定的野毒株。青蟹双顺反子病毒(mud crab dicistrovirus,MCDV)、对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、十足目虹彩病毒 1(Decapod iridescent virus 1,DIV1)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemo
8、lyticus)5 种病原核酸均来自本实验室保存的病原样品。1.2 主要试剂和总 RNA 提取 TB Green、反转录试剂盒(Primescript RT Master Mix)、DNA Marker 等均购自 TaKaRa 公司,总 RNA 提取试剂盒(Transzol UP Plus RNA Kit)购自北京全式金生物。将青蟹冰浴 5 min 后,用无菌注射器抽取少量血淋巴(约 50 L)进行 RNA 抽提;随后,解剖青蟹,取鳃、肝胰腺、心、胃、肠和肌肉组织,抽提各组织的总 RNA。总 RNA 提取及反转录具体步骤按照试剂盒操作说明书进行,以总 RNA 为模板,热变性后加入随机引物进行反
9、转录,合成的 cDNA 用于随后的定量分析。1.3 引物设计与合成 参考 MCRV 基因组 12 个节段序列(GenBank编号 HQ414127.1-HQ414138.1),利用在线软件预测病毒全部基因的编码区,在病毒基因编码序列内部设计定量引物;与此同时,选择 18S rRNA 作为内参基因并设计其定量引物。上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1.4 MCRV 在青蟹各组织中的相对含量分析 MCRV 阳性青蟹采自浙江某养殖场,选取 6 只青蟹用于分析病毒侵染的组织分布情况。使用 qRT-PCR方法分析 MCRV 在各组织中的相对含量,病毒基因引物为 VP11RF 和 VP11
10、RR,内参基因引物为 18SF和 18SR(表 1)。qRT-PCR 体系和参数采用仪器推荐的快速反应程序。反应体系:TB Green 10 L,上、下游引物各 0.4 L(10 mol/L),无菌水 6.8 L,cDNA 模板 2 L,ROX 染料 0.4 L,总体积为 20 L。反应参数:95 预变性 3 min;95 变性 10 s,60 退火 60 s,读板 1 次;共 40 个循环;最后,将温度从 60 提高到 95,期间每增加 0.5 检测 1 次荧光值。反应体系样品加入 96 孔反应板后置于荧光定量 PCR 仪(QuantStudio 6 Flex,ABI)上进行检测。病毒在各组
11、织中的相对含量按照公式(病毒相对含量=218S rRNA CTMCRV CT)进行计算。使用 GraphPad Prism 9软件对数据进行处理,t 检验进行显著分析。1.5 MCRV 编码基因在血淋巴中的表达水平分析 为分析 MCRV 基因相对表达水平,对 13 个预测的病毒基因分别设计并合成相应特异性引物(表 1)。以 18S rRNA 作为内参基因,通过 qRT-PCR 分析各基因的相对表达量。病毒感染青蟹血淋巴 cDNA 作为定量反应体系模板,反应条件和体系采用步骤 1.4 的快速反应程序。使用 OriginPro 9.1 软件对数据进行处理,t 检验进行显著分析。1.6 病毒 VP1
12、1 基因核酸片段扩增 以病毒 cDNA 为模板,利用引物 MCRVVP11F1和 MCRVVP11R1 进行 PCR 扩增,获取制备标准品质粒的核酸片段。反应体系:Ex Taq 酶 25 L,灭菌水20 L,上下游引物各 2 L(10 mol/L),模板 cDNA 174 渔 业 科 学 进 展 第 44 卷 表 1 引物序列信息 Tab.1 Primers used in this study 基因名称 Gene name 引物名称 Primer name引物序列 Primers(53)扩增片段 Amplicon/bpqRT-PCR目标基因 qRT-PCR target gene VP1 M
13、CRVVP1RF GTTCCTTGGACAGGCACTCA 115 MCRVVP1RR CGATGGAAATCTTGCCCTGA VP2 MCRVVP2RF ATTCGTAGACGGCGAGGGA 111 MCRVVP2RR GGTGAGAATTTCTTGCCCTGG VP3 MCRVVP3RF GGACCTAATGATGAGGCAACG 124 MCRVVP3RR AGGTGTTTGGACCCAGTATTTG VP4 MCRVVP4URF TGGGCTGGTCCCTACCTTTA 150 MCRVVP4URR TAGCTGGGTTGGCTCGTTTG MCRVVP4DRF TTTCAAAGG
14、TTTCACGGTCAC 161 MCRVVP4DRR TCCTCACGCATTATCATACATCT VP5 MCRVVP5RF TCGTGATTGAACAAGGGCAG 199 MCRVVP5RR AACAGGTCGTGATACGGCTCT VP6 MCRVVP6RF TCCGCAACAAAGAAGATACAGT 114 MCRVVP6RR AGTCACCAAGCGTGCTAAAAC VP7 MCRVVP7RF GCTGAGACCATTCTGGGCTAT 123 MCRVVP7RR GACGATAGTGACTCTGACCATTG VP8 MCRVVP8RF CAGCCTACAAGCAATG
15、GGAAT 77 MCRVVP8RR GCCTCTTTTGGCACGGGTT VP9 MCRVVP9RF TCTGACCGATGAGGATACTTC 159 MCRVVP9RR ATCTTCTCGACTATGACCTTTGT VP10 MCRVVP10RF TCACCACCGCCCTATCCTGT 171 MCRVVP10RR CGAGTCCGTAAGAGTCCTAATGT VP11 MCRVVP11RF CACCCCTAACCACCATCCCTAT 104 MCRVVP11RR CTTCCTAATCGCAAAGAACAACC VP12 MCRVVP12RF GGTAATGGTGCCAAATC
16、GTT 198 MCRVVP12RR TCCAGGTGGTGGTTTGATGT qRT-PCR 内参基因 qRT-PCR reference gene 18S RNA 18SF CAGACAAATCGCTCCACCAAC 121 18SR GACTCAACACGGGGAACCTCA RT-PCR VP11核酸片段VP11 fragment MCRVVP11F1 CACCCCTAACCACCATCCCTAT 725 MCRVVP11R1 GCAAATTGAACTACTACTACTTA (200 ng/L)1 L,总体积 50 L。PCR 条件:95 预变性 3 min;95 变性 30 s,55
17、 退火 45 s,72 延伸 50 s,共 35 循环;72 延伸 10 min,终止反应。1.7 标准品质粒构建与稀释 病毒 VP11 基因片段 PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分析,目标片段回收后连接到 pMD19-T 载体,随后转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5 感受态细胞,将 PCR 筛选获得的阳性克隆菌株进行培养。按 照质粒提取试剂盒(TaKaRa)说明书提取质粒,送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。确认质粒构建成功后,通过超微量分光光度计测其OD260 nm和OD280 nm值(1 OD 吸光值相当于 50 g/mL 的 dsDNA),从而确定质粒纯度并计
18、算质粒总质量。每微升质粒拷贝数(copies/L)=质粒质量浓度(g/L)/质粒分子量;质粒分子量=2330nt(其中,nt 为质粒的碱基数)。将标准品质粒进行 9 次 10 倍稀释,直到 100 copies/L,20 保存备用。第 5 期 储 旭等:一种筛选无青蟹呼肠孤病毒(MCRV)种蟹的荧光定量 RT-PCR 检测方法及其应用 175 1.8 SYBR Green qRT-PCR 体系及相关参数的确定 以含 VP11 基因片段的标准品质粒为模板,使用引物 VP11RF 和 VP11RR 进行 qRT-PCR,通过分析PCR 产物的熔解曲线,确定引物的特异性与可行性。在此基础上,通过正交
19、实验确定上、下游引物的最佳配比浓度(获得最小的 CT值),并通过温度梯度实验,优化退火温度,由此建立最佳反应条件,并最终确定反应参数。1.9 标准曲线绘制及引物扩增效率计算 将 1.7 中系列稀释标准品作为反应模板,每个梯度设置 5 个重复,按照所建立的 qRT-PCR 体系和参数进行反应,由仪器自动绘制标准曲线并生成线性方程和相关系数(R2),根据斜率的线性方程计算引物的扩增效率。利用统计学方法计算各梯度 CT值的变异系数(CV),分析其重复性和稳定性。1.10 qRT-PCR 的灵敏性检测 在 1.7 中标准品质粒 10 倍系列稀释基础上,进一步制备了 50、25 和 12.5 copie
20、s/L 标准品质粒。将倍比稀释质粒作为模板进行 qRT-PCR,通过分析 CT值变异系数,确定该方法的检测极限值。1.11 qRT-PCR 特异性检测 为分析该检测方法的特异性,以携带 MCRV 鳃组织样本作为阳性对照,以健康青蟹鳃组织 cDNA 样本作为阴性对照,使用甲壳类常见病原核酸样本,如MCDV 的 cDNA 以及 WSSV、DIV1、EHP 或副溶血弧菌的 DNA,进行 qRT-PCR,分析该检测方法的特异性。1.12 MCRV 感染情况调查 为评估 MCRV qRT-PCR 检测方法的实用性、了解MCRV 感染状况,使用该检测方法对来自海南的 22 只种蟹和浙江的 20 只商品青蟹
21、分别进行 MCRV 检测。1.13 MCRV 在青蟹体内的增殖模式分析 从上海某养殖场购买的青蟹经检测无 MCRV 感染后,挑选规格大体一致的健康青蟹 6 只(约 250 g/只),用于病毒感染实验,实验水温设为 21。按照熊娟(2011)的方法制备病毒粗提液,并将 200 L 病毒粗提液从步足基部注入实验组青蟹体内。分别在病毒感染 0、24、48、72、96、120、144、168 和 192 h 时抽取少量血淋巴(约 50 L/只)提取 RNA,用于分析病毒相对含量。病毒感染期间,统计青蟹死亡情况。2 结果与分析 2.1 MCRV 在感染青蟹的血淋巴和鳃中含量最高 MCRV 在感染青蟹各组
22、织中的相对含量见图 1,病毒分布于所有检测组织中,其中,血淋巴和鳃组织中的病毒含量显著高于其他组织,病毒相对含量平均值由高到低依次为血淋巴、鳃、肠、心脏、胃、肝胰腺和肌肉。实验结果提示,以血淋巴作为 MCRV 检测的采样组织,能提高检测方法的灵敏性。图 1 MCRV 的组织分布 Fig.1 Relative load of MCRV in different tissues 不同字母表示组间差异显著。下同。Different letters indicate significant differences among groups.The same as below.2.2 病毒 VP11 基
23、因表达水平最高 MCRV 是具有合成 mRNA 能力的双链 RNA 病毒,为分析病毒各基因相对表达量(含基因组序列),实验使用随机引物对血淋巴总 RNA 进行反转录,合成病毒及其转录本 cDNA 作为基因表达量分析的模板。以病毒基因特异引物(13 对引物)和内参基因引物分别检测各基因的相对表达量。结果显示,在 MCRV感染过程中,各基因表达存在显著差异(图 2)。其中,VP11 基因相对表达量的平均值最高,显著高于其他多数基因。研究结果提示,以 VP11 基因序列设计引物进行病毒检测,能显著提高检测灵敏性。176 渔 业 科 学 进 展 第 44 卷 2.3 含 VP11 基因片段标准品质粒的
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- 一种 筛选 无青蟹呼肠孤 病毒 28 MCRV 29 荧光 定量 RT PCR 检测 方法 及其 应用
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