新型冠状病毒刺突蛋白对单核巨噬细胞分泌炎症因子的影响.pdf
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1、新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.334 基金项目:河北省重点研发计划(20277746D)通信作者:闫会敏,Email: 引用格式:丁芳,江平,李力,等.新型冠状病毒刺突蛋白对单核巨噬细胞分泌炎症因子的影响J/CD.新发传染病电子杂志,2023,8(3):34-38.Ding Fang,Jiang Ping,Li Li,et al.Effect of novel coronavirus spike protein on the se
2、cretion of inflammatory factors by mononuclear macrophagesJ/CD.Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,2023,8(3):34-38.论著丁芳,江平,李力,张鑫,戴二黑,闫会敏(石家庄市第五医院临床医学研究所,河北 石家庄 050021)新型冠状病毒刺突蛋白对单核巨噬细胞分泌炎症因子的 影响【摘要】目的 探讨SARS-CoV-2对单核巨噬细胞分泌炎症因子的作用及机制。方法 纳入石家庄市第五医院2020年1月21日至2月10日以及2021年1月3日至1月7日住院的COVI
3、D-19确诊患者(病例组)与健康对照者(对照组)各53例,收集病例资料与血常规检测结果。采用SARS-CoV-2刺突蛋白刺激单核巨噬细胞,细胞增殖-毒性检测细胞活力,荧光定量PCR法检测炎症因子IL-6、IL-1和CCL2与信号通路分子JAK1、STAT1和NF-B的表达。结果 COVID-19患者的单核细胞比值与中性粒细胞比值高于对照组,而淋巴细胞比值、淋巴细胞计数、嗜酸性粒细胞比值、嗜酸性粒细胞计数与红细胞压积低于对照组。SARS-CoV-2刺突蛋白刺激单核巨噬细胞后,在100ng/ml与300ng/ml的浓度下细胞活力高于对照组(P=0.046),在浓度为500ng/ml时IL-6、IL
4、-1与CCL2的mRNA表达含量最高(P0.01,P=0.036,P0.001),在浓度100ng/ml时JAK1与STAT1的mRNA表达明显升高(P0.001),在300ng/ml与500ng/ml刺激下,NF-B表达增高(P0.001)。结论 COVID-19患者的单核细胞升高,SARS-CoV-2刺突蛋白可能通过JAK1/STAT1信号通路促进单核巨噬细胞分泌炎症因子,在细胞因子风暴中发挥作用。【关键词】新型冠状病毒;刺突蛋白;单核巨噬细胞;炎症因子;细胞因子风暴;信号通路 DOI:10.19871/ki.xfcrbzz.2023.03.007 【中图分类号】R512.99Effect
5、 of novel coronavirus spike protein on the secretion of inflammatory factors by mononuclear macrophagesDing Fang,Jiang Ping,Li Li,Zhang Xin,Dai Erhei,Yan Huimin(Clinical Research Center,Shijiazhuang Fifth Hospital,Shijiazhuang Hebei 050021,China)【Abstract】Objective The aim of this study was to inves
6、tigate the role and mechanism of SARS-CoV-2 virus on the secretion of inflammatory factors by mononuclear macrophages.Method Fifty-three patients with confirmed COVID-19 hospitalized from January 21 to February 10,2020 and January 3 to January 7,2021 were selected from Shijiazhuang Fifth Hospital,fi
7、fty-three healthy controls each were included,and the results of medical records and routine blood test were collected.Mononuclear macrophages were stimulated with SARS-CoV-2 virus spiked protein,cell viability was detected by CCK-8 assay.The level of pro-inflammatory cytokines IL-6,IL-1 and CCL2 an
8、d the expression of signaling pathway molecules JAK1,STAT1 and NF-B were detected by quantitative RT-PCR.Result The monocyte ratio and neutrophil ratio were higher,while the lymphocyte ratio,lymphocyte count,eosinophil ratio,and eosinophil count,and hematocrit were lower in COVID-19 patients than th
9、ose in controls.After stimulation of mononuclear macrophages by SARS-CoV-2 virus spiked protein,cell viability was higher at concentrations of 100ng/ml and 300ng/ml(P=0.046).The highest mRNA expression levels of IL-6,IL-1 and CCL2 at a concentration of 500ng/ml(P0.01,P=0.036,P0.001).The expression o
10、f JAK1 and STAT1 at a concentration of 100ng/ml(P0.001),the expression of NF-B expression was increased at 300 and 500ng/ml stimulation(P0.001).Conclusion SARS-CoV-2 viral spike protein may promote inflammatory cytokine secretion by mononuclear macrophages through the JAK1/STAT1 signaling pathway,wh
11、ich play a role in the cytokine storm.【Key words】Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2;Spike protein;Mononuclear macrophages;Inflammatory cytokine;Cytokine storm;Signal pathway 35 新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.3COVID-19疫情在
12、全球大流行过程中出现了多种SARS-CoV-2变异毒株,部分毒株传播能力强,波及范围广1。大多数感染SARS-CoV-2的患者可出现轻度至中度症状,部分患者可发展为重症或危重症,甚至死亡2。研究发现SARS-CoV-2感染导致的严重损伤,除与病毒借助血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)受体直接进入攻击靶细胞外,还与免疫系统过度反应造成炎症因子风暴有密切关系3-4。激活的单核巨噬细胞是炎症因子的重要来源。由于单核细胞不表达ACE2受体,而巨噬细胞的ACE2含量也很低,目前普遍认为SARS-CoV-2主要是通过间接方式来影响单核巨噬细胞,即
13、病毒在肺部上皮细胞等靶细胞内进行复制,继而引起单核巨噬细胞异常激活产生促炎症细胞因子,这些促炎症细胞因子又趋化更多的炎症细胞参与,从而加剧肺组织损伤5。然而,SARS-CoV-2是否对单核巨噬细胞具有直接作用尚存在争议。SARS-CoV-2基因组编码29种蛋白,其中刺突蛋白(spike protein,S蛋白)是SARS-CoV-2最大的结构蛋白,负责使病毒进入宿主细胞,也可介导机体免疫反应3-4,6-7。本研究旨在阐明SARS-CoV-2 S蛋白对单核巨噬细胞分泌炎症因子的作用,并初步解析其分子机制。1 资料与方法1.1 研究对象选择石家庄市第五医院2020年1月21日至2月10日以及202
14、1年1月3日至1月7日所有住院的COVID-19确诊患者共53例,平均年龄(50.6815.75)岁,男性25例,女性28例;其中轻型患者4例,普通型患者39例,重型患者10例。新型冠状病毒感染患者的临床诊断以国家卫生健康委员会发布的新型冠状病毒肺炎诊疗方案(第八版)为依据,所有患者均经过SARS-CoV-2核酸检测和胸部CT扫描进行确诊,治疗措施包括对症治疗、抗病毒治疗和呼吸支持等。同时收集年龄和性别相匹配的53例健康成人作为对照组。每例患者入院后采集患者清晨空腹静脉血进行检测,使用血细胞分析仪以及配套试剂检测血常规指标。通过医院电子病例系统以及检验系统收集研究对象的病例资料与实验室指标。本
15、研究经石家庄市第五医院伦理委员会批准(编号:2020007)。1.2 CCK-8法检测细胞活力 SARS-CoV-2 S蛋白购买自美国R&D公司,来自人胚胎肾细胞HEK293。将J774A.1小鼠单核巨噬细胞(武汉普诺赛)培养在含15%的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的改良伊格尔高糖培养基中,放置于5%CO2,37细胞培养箱,细胞生长至汇合度80%90%进行细胞传代。取100l的1.2105个/ml的细胞悬浮液接种细胞至96孔板,预培养24h后,加入含不同浓度的重组SARS-CoV-2 S蛋白(美国R&D公司)的完全培养基刺激单核巨噬细胞,每组3个复孔,培养24h后加
16、入CCK-8液,测量450nm处吸光度值。1.3 荧光定量PCR(qPT-PCR)法检测mRNA的表达 将单核巨噬细胞培养在6孔板中,分别加入含100ng/ml(7.46102nmol/ml)、300ng/ml(2.24103nmol/ml)和500ng/ml(3.73103nmol/ml)终浓度S蛋白的培养基中,培养6h后收集细胞,加入天漠生物公司的TRIcom RNA裂解液,使用小量总RNA提取试剂盒提取RNA。利用ABScript RT反应混合物(ABclonal公司),将样本放入PCR仪中反转录合成cDNA,反应程序为25 5min,42 15min,85 5s。采用2通用型SYBR
17、Green Fast qPCR Mix试剂盒(ABclonal公司)进行实时荧光定量PCR,反应参数:95 3min;95 5s,60 34s,45个循环,在退火阶段收集荧光信号,记录溶解曲线和扩展曲线,使用2-ct法计算相对表达量。PCR引物序列见表1。蛋白正向引物(5-3)反向引物(3-5)IL-6TGCCTTCTTGGGACTGATGCTGAAGTCTCCTCTCCGGACTIL-1GCAGTGGTTCGAGGCCTAATGCTGCTTCAGACACTTGCACCCL2GTCTGTGCTGACCCCAAGAAAAGGCATCACAGTCCGAGTCNF-BCGGCCTCATCCACATG
18、AACTATGTGAGAGGACAGGGGTCAJAK1AAGGAAAGCGTCTGCCATGTAAATGGCTTGGGAGAGAAGGASTAT1GATGGTTCTGGTCGTGGGTTAGGACTGTGCACACTTACCG表1 荧光定量RCR检测基因对应的引物序列1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布时用(x-s)表示,两组之间使用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验(方差齐)或Dunnett-t检验(方差不齐);不符合正态分布的计量资料以中位数(四分位数)M(P25,P75)表示,两组或多组间比较采用秩和检验;
19、计数资料采用卡方检验。以P 0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 COVID-19患者外周血细胞的变化 COVID-19患者中性粒细胞比值和单核细胞比值高于正常值的比例分别为16.98%和15.10%,明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05);而淋巴细胞比值、淋巴细胞计数、嗜酸性粒细胞比值、嗜酸性粒细胞计数与红细胞新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.336 项目病例组对照组统计值P值中性粒细胞比值9.1870.004 40%
20、2(3.77)0(0)正常42(79.25)52(98.11)75%9(16.98)1(1.89)单核细胞比值10.5590.003 3%0(0)2(3.77)正常45(84.90)51(96.23)10%8(15.10)0(0)淋巴细胞比值10.0360.004 20%13(24.53)2(3.77)正常38(71.70)50(94.34)50%2(3.77)1(1.89)嗜酸性粒细胞比值47.4210.001 0.4%36(67.92)2(3.77)正常17(32.08)51(96.23)红细胞压积8.5200.014 40%25(47.17)12(22.64)正常27(50.94)36(
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