小鼠黑色素细胞沉默及过表达色素上皮衍生因子对黑色素合成的影响.pdf
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1、畜牧兽医学报 2 0 2 3,5 4(9):3 9 1 6-3 9 3 0A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i:1 0.1 1 8 4 3/j.i s s n.0 3 6 6-6 9 6 4.2 0 2 3.0 9.0 3 0开放科学(资源服务)标识码(O S I D):小鼠黑色素细胞沉默及过表达色素上皮衍生因子对黑色素合成的影响梁 睿1,范小瑞1,张晋强2,庞全海1*(1.山西农业大学动物医学学院,太谷 0 3 0 8 0 1;2.中华人民共和国晋阳海关,太原 0 3 0 0 2 7)
2、摘 要:旨在研究色素上皮衍生因子(p i g m e n t e p i t h e l i u m-d e r i v e d f a c t o r,P E D F)与黑色素合成调控因子之间的互作关系,探索P E D F对黑色素细胞活力和黑色素合成的调控作用,为研究动物毛色形成机制提供基础。本研究将P E D F s i R NA及P E D F过表达载体分别转染小鼠黑色素细胞,对黑色素细胞活力、黑色素含量进行检测,采用q R T-P C R、W e s t e r n b l o t t i n g及细胞免疫荧光对P E D F、W n t 1、Wn t 3、M I T F和-c a t
3、 e n i n的表达和定位进行检测。黑色素细胞P E D F沉默后,黑色素细胞的细胞活力增强,黑色素含量增加,Wn t 1、W n t 3、M I T F和-c a t e n i n的mR NA和蛋白表达量升高;黑色素细胞P E D F过表达后,黑色素细胞活力减弱,黑色素含量减少,W n t 1、W n t 3、M I T F和-c a t e n i n的mR NA和蛋白表达量降低。细胞免疫荧光结果显示:P E D F、W n t 1、M I T F、-c a t e n i n表达于黑色素细胞的细胞质;Wn t 3 表达于黑色素细胞的细胞质和细胞膜。本研究证实:P E D F使黑色素细
4、胞活力减弱,可通过下调促黑色素生成相关的因子Wn t 1、Wn t 3、M I T F和-c a t e n i n,从而抑制黑色素的生成。关键词:色素上皮衍生因子;P E D F;沉默和过表达;黑色素;小鼠黑色素细胞中图分类号:Q 3 4 2 文献标志码:A 文章编号:0 3 6 6-6 9 6 4(2 0 2 3)0 9-3 9 1 6-1 5收稿日期:2 0 2 3-0 4-0 6基金项目:国家自然科学基金项目(3 2 2 7 3 0 8 9;3 1 8 7 2 5 3 2;3 1 2 7 2 6 2 8)作者简介:梁 睿(1 9 9 0-),女,山西和顺人,博士生,主要从事动物干细胞生
5、物学研究,E-m a i l:d a b a o r u i r u i 1 2 6.c o m*通信作者:庞全海,主要从事动物干细胞生物学、临床兽医学研究,E-m a i l:p a n g q u a n h a i 1 6 3.c o mE f f e c t s o f M o u s e M e l a n o c y t e S i l e n c i n g a n d O v e r e x p r e s s i o n o f P i g m e n t E p i t h e l i u m-D e r i v e d F a c t o r o n M e l a n
6、i n S y n t h e s i sL I ANG R u i1,F AN X i a o r u i1,Z HANG J i n q i a n g2,P ANG Q u a n h a i1*(1.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e,S h a n x i A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,T a i g u 0 3 0 8 0 1,C h i n a;2.J i n y a n g C u s t o m s o f t h e P e o p l es R
7、 e p u b l i c o f C h i n a,T a i y u a n 0 3 0 0 2 7,C h i n a)A b s t r a c t:T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o i n v e s t i g a t e t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n p i g m e n t e p i t h e l i-u m-d e r i v e d f a c t o r(P E D F)a n d m e l a n i n s y n t h e s i
8、 s r e g u l a t o r y f a c t o r s,a n d t o e x p l o r e t h e r e g u l a t o-r y e f f e c t s o f P E D F o n m e l a n i n c e l l v i t a l i t y a n d m e l a n i n s y n t h e s i s,s o a s t o p r o v i d e a b a s i s f o r t h e s t u d y o f a n i m a l c o a t c o l o r f o r m a t i
9、 o n m e c h a n i s m.I n t h i s s t u d y,P E D F s i R NA a n d P E D F o v e r-e x p r e s s i o n v e c t o r w e r e t r a n s f e c t e d i n t o m o u s e m e l a n o c y t e s r e s p e c t i v e l y,a n d t h e a c t i v i t y o f m e l a-n o c y t e s a n d c o n t e n t o f m e l a n i
10、n w e r e d e t e c t e d.T h e e x p r e s s i o n a n d l o c a l i z a t i o n o f P E D F,Wn t 1,Wn t 3,M I T F a n d-c a t e n i n w e r e d e t e c t e d b y q R T-P C R,W e s t e r n b l o t t i n g a n d c e l l u l a r i mm u n o-f l u o r e s c e n c e.A f t e r P E D F s i l e n c i n g,t
11、 h e c e l l v i t a l i t y o f m e l a n o c y t e s w a s e n h a n c e d,t h e c o n t e n t o f m e l a n i n w a s i n c r e a s e d,a n d t h e mR NA a n d p r o t e i n e x p r e s s i o n s o f Wn t 1,Wn t 3,M I T F a n d-c a t e n i n w e r e i n c r e a s e d.A f t e r P E D F o v e r e x
12、 p r e s s i o n i n m e l a n o c y t e s,t h e a c t i v i t y o f m e l a n o-c y t e s w a s w e a k e n e d,t h e c o n t e n t o f m e l a n i n w a s d e c r e a s e d,a n d t h e mR NA a n d p r o t e i n e x p r e s-9期梁 睿等:小鼠黑色素细胞沉默及过表达色素上皮衍生因子对黑色素合成的影响s i o n s o f Wn t 1,Wn t 3,M I T F a
13、n d-c a t e n i n w e r e d e c r e a s e d.C e l l u l a r i mm u n o f l u o r e s c e n c e r e s u l t s s h o w e d t h a t P E D F,Wn t 1,M I T F a n d-c a t e n i n w e r e e x p r e s s e d i n t h e c y t o p l a s m o f m e l a n o c y t e s.Wn t 3 w a s e x p r e s s e d i n t h e c y t o
14、 p l a s m a n d c e l l m e m b r a n e o f m e l a n o c y t e s.T h i s s t u d y c o u l d c o n-f i r m t h a t P E D F c o u l d r e d u c e t h e a c t i v i t y o f m e l a n o c y t e s,a n d i n h i b i t t h e p r o d u c t i o n o f m e l a n i n b y d o w n-r e g u l a t i n g t h e f a
15、 c t o r s r e l a t e d t o m e l a n i n p r o d u c t i o n,Wn t 1,Wn t 3,M I T F a n d-c a t e n i n.K e y w o r d s:p i g m e n t e p i t h e l i u m-d e r i v e d f a c t o r;P E D F;s i l e n c e a n d o v e r e x p r e s s i o n;m e l a n i n;m o u s e m e l a n o c y t e*C o r r e s p o n d
16、 i n g a u t h o r:P ANG Q u a n h a i,E-m a i l:p a n g q u a n h a i 1 6 3.c o m 在哺乳动物皮肤组织中,黑色素的数量及类型对毛色起重要作用1。同时,黑色素是动物皮肤组织的“遮阳伞”,保护动物机体皮肤免受太阳紫外线辐射引起的D NA损伤和突变2。胚胎时期的神经嵴细胞(n e u r a l c r e s t c e l l s,N C C)是黑色素前体细胞的起源,前体细胞经逐步分化、发育形成黑色素细胞,黑色素由黑色素细胞中的细胞器黑色素小体产生3。黑色素的合成及动物皮肤组织色素沉着受到多种遗传基因和发育途径的调
17、控4。Wn t信号通路在神经嵴黑色素细胞的发育过程中具有重要作用,研究证实,增强Wn t 1信号能够使具有内皮素3(e n d o t h e l i n 3,E D N 3)依赖性的神经嵴黑色素细胞数量增加,增强神经嵴黑色素细胞的色素沉着5。Wn t 3 通过经典通路在黑色素细胞的发育过程中起重要的调控作用,可以促进神经嵴细胞分化为黑色素细胞6,可显著增强酪氨酸蛋白激酶活性和黑色素的合成7,缺乏Wn t 1和Wn t 3 的突变小鼠几乎完全缺失神经嵴细胞起源的黑色素细胞8。小眼畸 形 相 关 转 录 因 子(m i c r o p h t h a l m i a-a s s o c i a
18、t e d t r a n s c r i p t i o n f a c t o r,M I T F)是黑色素细胞发育、生存和发挥功能的重要调节因子,M I T F基因缺失的小鼠表现出神经嵴来源的黑色素细胞丢失9-1 0。这些因子之间存在相互作用,Wn t 3 通过作用于黑色素母细胞维持M I T F的表达,从而促进黑色素母细胞分化形成黑色素细胞1 1,也可通过上调M I T F的表达,增加酪氨酸酶活性,促进黑色素合成6。经典Wn t通路通过-c a t e n i n的积累实现,因此也称作Wn t/-c a t e n i n通路1 2,-c a t e n i n与M I T F的近端启
19、动子存在相关性1 3,提示-c a t e n i n在黑色素生成中发挥关键作用。色素 上 皮 衍 生 因 子(p i g m e n t e p i t h e l i u m-d e-r i v e d f a c t o r,P E D F)是一种5 0 k u的分泌型糖蛋白,属于非抑制性丝氨酸家族1 4。研究证实,在人黑色素细胞中,存在P E D F的表达,且P E D F蛋白在健康皮肤组织的表达量最高,其次是色素痣,在黑色素瘤的表达量最低1 5;P E D F对黑色素细胞的过度增殖有抑制作用1 6。虽然P E D F对黑色素细胞的生物学活性和黑色素的合成具有调控作用,但具体的调控机制
20、尚不清楚,调控黑色素合成的关键因子与P E D F之间是否存在互作关系也尚不明确。因此,本研究选取小鼠黑色素细胞,探索P E D F与黑色素合成相关因子之间是否存在互作关系,以期探索P E D F对哺乳动物皮肤组织黑色素合成的调控作用。为进一步研究动物毛色形成提供基础,同时也为动物经济性状育种提供理论基础。1 材料与方法1.1 试验动物选取出生1 d以内的野生型C 5 7 B L/6小鼠,雄性和雌性各3只,取下整块背部皮肤(经山西农业大学实验动物伦理委员会审批),用于黑色素细胞的分离培养。1.2 主要试剂R NA提取试剂盒(上海生工生物技术股份有限公司),反转录试剂盒、荧光定量试剂盒(北京全式
21、金生物技术有限公司),R I P A裂解液、蛋白酶抑制剂PM S F(上海碧云天生物技术有限公司),B C A蛋白浓度测定试剂盒、E C L显色液、D A P I试剂(中杉金桥生物技术有限公司),s i R NA(通用生物股份有限公司);脂质体2 0 0 0(I n v i t r o g e n公司);腺病毒穿梭质粒p D C 3 1 6-m CMV-E G F P(S t r a t a g e n e)、腺病 毒辅助 质 粒p B HG l o x(d e l t a)E 1,3 C r e(M i c r o b i x)、DH5感受态细胞(T h e r m o公司)。多克隆兔抗P
22、E D F抗体(北京博奥森生物技术有限 公 司),Wn t 1和Wn t 3 兔 抗 多 克 隆 抗 体、M I T F、-c a t e n i n和GA P DH兔抗单克隆抗体(A b-c a m)、HR P-驴抗兔I g G(北京索莱宝科技有限公7193畜 牧 兽 医 学 报5 4卷 司),驴 抗 兔A l e x a F l u o r TM P l u s 5 9 4荧 光 二 抗(T h e r m o公司)。1.3 小鼠黑色素细胞的分离培养分别取小鼠整块背部皮肤,置入含双抗的P B S中,0.2 5%的D i s p a s e 酶4 过夜消化。分离表皮与真皮,将表皮剪碎置于0.
23、2 5%的胰蛋白酶中3 7 水浴消化。加终止液终止消化,过滤并离心。弃上清,加入DMEM培养基,部分进行细胞计数。剩余部分置入6孔培养板中3 7 5%C O2培养1 h,更换黑色素细胞专用培养基。培养至小鼠黑色素细胞的细胞密度达到9 0%左右时,0.2 5%胰蛋白酶消化液3 7 消化,终止。离心弃上清,加入R P-M I-1 6 4 0培养基重悬培养。1.4 s i R N A的合成与转染黑色素细胞根据G e n B a n k中已登录的小鼠P E D F mR NA序列(NM_0 1 1 3 4 0.3),参考s i R NA设计原则,设计合成3对s i R NA及阴性对照。用于P E D
24、F基因沉默的s i R NA由通用生物技术有限公司通过常规化学合成,详细的序列信息见表1。黑色素细胞生长到占六孔板面积6 0%8 0%,进行转染。设置阴性对照组(n e g a t i v e c o n t r o l,N C)、P E D F-s i R NA组(包 括P E D F-s i R NA 1、P E D F-s i R NA 2、P E D F-s i R NA 3)。首 先,制 备N C、s i R NA稀 释 液:用1 0 0 L不 含 血 清 双 抗 的 培 养 基 分 别 稀 释N C、P E D F-s i R NA 1、P E D F-s i R NA 2、P E
25、 D F-s i R NA 3,终浓度为1 0 0 n m o lL-1。其次,制备 转 染 试 剂:用1 0 0 L不含血清双抗的培养基稀释2 L脂质体2 0 0 0转染试剂,混匀,常温静置5 m i n。最后,将转染试 剂 与N C、s i R NA稀 释 液 混 匀,室 温 静 置2 0 m i n。将转染复合物加入6孔板中,2 0 0 L孔-1,前后轻摇细胞板混合均匀,细胞板置于3 7 5%C O2培养箱中培养4 8 h,提取总蛋白和R NA进行测定。1.5 P E D F过表达载体的构建与电转染黑色素细胞 提取小鼠黑色素细胞R NA,反转录合成c D-NA,根据G e n B a n
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