污水中分离的大肠杆菌噬菌体和金黄色葡萄球菌噬菌体的生物学特性分析.pdf
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1、第 卷第期年月西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)J o u r n a l o fX ia nJ i a o t o ngU n i v e r s i ty(M e d i c a l S c i e n c e s)V o l N o S ep 本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版公共卫生研究污水中分离的大肠杆菌噬菌体和金黄色葡萄球菌噬菌体的生物学特性分析王香妮,马彩琴,刘进仁,刘娜,王曦迎,鹿佳佳,康楚楚,石兴民,袁网(西安交通大学医学部公共卫生学院,陕西西安 ;西安交通大学第一附属医院P E T C
2、T室,陕西西安 ;运城职业技术大学,山西运城 ;空军军医大学第二附属医院医务处,陕西西安 )摘要:目的以污水中分离的大肠杆菌噬菌体(E s c h e r i c h i ac o l i p h a g e,E C P)和金黄色葡萄球菌噬菌体(S t a p h y l o c o c c u sa u r e u sp h a g e,S A P)作为研究对象,初步分析其生物学特性,为研究噬菌体应用提供新的实验材料.方法采用双层琼脂法纯化E C P和S A P,利用扫描电镜观察形态特征,通过最佳感染复数(m u l t i p l i c i t yo f i n f e c t i o
3、n,MO I)实验、一步生长曲线实验、温度、p H、氯仿及紫外线敏感性实验进行生物学特性分析.结果根据形态将两种噬菌体归为肌尾噬菌体科,最佳MO I均为,均对紫外线具有较强的抵抗力.E C P和S A P的潜伏期分别为 m i n和 m i n,子代噬菌体裂解量分别为 P F U/c e l l和P F U/c e l l.E C P对温度耐受范围较宽,能在 稳定存活,而S A P对温度较敏感,在 的条件下,作用h,即可完全失活;E C P在p H为 的范围内,S A P在p H为的范围内维持较好的裂解活性;E C P对氯仿具有较强的耐受性,为无囊膜型噬菌体,而S A P对氯仿较敏感,为囊膜型
4、噬菌体.结论E C P和S A P均为烈性噬菌体,对紫外线有较强的抵抗力;E C P的裂解性、对温度、p H及氯仿的耐受性均强于S A P.关键词:大肠杆菌;金黄色葡萄球菌;噬菌体;生物学特性;生物防治中图分类号:R 文献标志码:AD O I:/j d y x b 收稿日期:修回日期:基金项目:陕西省自然科学基础研究计划面上项目(N o J M );国家自然科学基金面上项目(N o ),陕西省青年基金项目(N o J Q )S u p p o r t e db yt h eN a t u r a l S c i e n c eB a s i cR e s e a r c hP r o g r
5、a mo f S h a a n x i P r o v i n c e(N o J M ),t h eG e n e r a l P r o g r a mo f t h eN a t i o n a lN a t u r a lS c i e n c eF o u n d a t i o no fC h i n a(N o )a n dS h a a n x iP r o v i n c eY o n t hF u n dP r o j e c t(N o J Q )通信作者:袁网 E m a i l:c o m网络出版地址:h t t p s:/k n s c n k i n e t/k
6、 c m s/a r t i c l e/a b s t r a c t?u r l I d R&u n i p l a t f o r mN Z K P T()B i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c so fE s c h e r i c h i ac o l ip h a g ea n dS t a p h y l o c o c c u sa u r e u sp h a g e i s o l a t e df r o ms e w a g eWANGX i a n g n i,MAC a i q i n,L I UJ i n r
7、 e n,L I U N a,WANGX i y i n g,L UJ i a j i a,KANGC h u c h u,S H IX i n g m i n,YUAN W a n g(S c h o o l o fP u b l i cH e a l t h,X ia nJ i a o t o n gU n i v e r s i t yH e a l t hS c i e n c eC e n t e r,X ia n ;D e p a r t m e n to fP E T C T,T h eF i r s tA f f i l i a t e dH o s p i t a l o f
8、X ia nJ i a o t o n gU n i v e r s i t y,X ia n ;Y u n c h e n gV o c a t i o n a l a n dT e c h n i c a lU n i v e r s i t y,Y u n c h e n g ;M e d i c a lA f f a i r sO f f i c e,S e c o n dA f f i l i a t e dH o s p i t a l,A i r f o r c eM i l i t a r yM e d i c a lU n i v e r s i t y,X ia n ,C
9、h i n a)A B S T R A C T:O b j e c t i v e E s c h e r i c h i ac o l iph age(E C P)a n dS t aphyl o c o c c u sa u r e u sph age(S A P)i s o l a t e df r o ms e w agew e r eu s e da s r e s e a r c ho bje c t s,a n dt h e i rb i o l ogi c a l c h a r a c t e r i s t i c sw e r ea n a lyz e dt opr o
10、v i d en e we xpe r i m e n t a lm a t e r i a l s f o r t h eap pl i c a t i o no fph age s M e t h o d sE C Pa n dS A Pw e r epu r i f i e da n dc u l t u r e dbyd o u b l e l aye raga rm e t h o d T h e nas e r i e so fb i o l ogi c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h e s et w oph age sw e r e
11、pr e l i m i n a r i lya n a lyz e dbye l e c t r o nm i c r o s c opeo b s e r v a t i o n,opt i m a lm u l t ipl i c i tyo f i n f e c t i o n(MO I)t e s t,o n e s t epgr o w t hc u r v e t e s t,t e mpe r a t u r e,pH,c h l o r o f o r ma n du l t r a v i o l e t s e n s i t i v i tyt e s t s,r e
12、 spe c t i v e lyR e s u l t s T h er e s u l t so fb i o l ogi c a lc h a r a c t e r i s t i c ss h o w e dt h a tE C Pa n dS A Pw e r eb o t hv i r u l e n tph age s,b e l o ngi ngt omyo v i r i d a cf a m i ly T h e i ropt i m a lMO Iw a s,a n dt h eyh a ds t r o ngr e s i s t a n c et ou l t r
13、a v i o l e t l igh t T h ec l e a v agev o l u m eo fE C Pw a s P F U/c e l l,w h i l et h a to fS A Pw a s P F U/c e l l E C Ph a daw i d er a ngeo f t e mpe r a t u r e t o l e r a n c ea n dc o u l ds t a b lys u r v i v ea t ,w h i l eS A P西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u
14、e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版w a sm o r es e n s i t i v et ot e mpe r a t u r ea n dc o u l db ec o mpl e t e lyi n a c t i v a t e da t f o rh E C Pc o u l dm a i n t a i nago o dlys i sa c t i v i tyi nt h er a ngeo fpH,w h i l eS A P i nt h e r a ngeo fpH E C Ph a d s t r o ngr e s i s t a n c e t
15、oc h l o r o f o r ma n dw a sn o n m e m b r a n o u sph age,w h i l eS A P w a s m o r es e n s i t i v et oc h l o r o f o r m a n d w a sa m e m b r a n o u sph age C o n c l u s i o n E C Pa n dS A Pa r eb o t hv i r u l e n tph age sa n dh a v es t r o ngr e s i s t a n c et ou l t r a v i o l
16、 e t l igh t T h elys a b i l i ty,t e mpe r a t u r e,pH,a n dc h l o r o f o r mt o l e r a n c eo fE C Pa r es t r o nge r t h a nt h o s eo fS A PK E Y WO R D S:E s c h e r i c h i ac o l i;S t aphyl o c o c c u s a u r e u s;ph age;b i o l ogi c a l c h a r a c t e r i s t i c;b i o l ogi c a l
17、pr e v e n t i o na n dc o n t r o l大肠杆菌是人类和动物肠道及环境中的正常栖息菌,大多数大肠杆菌无致病性,但可引起机会性感染,一些高致病性菌株可导致腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒症综合征、尿路感染、败血症和新生儿脑膜炎等 .金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属革兰氏阳性球菌,在哺乳动物中的传播范围较广,可引起败血症等疾病.大肠杆菌、金黄色葡萄球菌都是导致严重食源性疾病的细菌,主要通过食用受污染的食物、水传播给人类.而大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抗生素耐药性的出现已成为一个全球公共卫生问题,这限制了细菌感染的控制.噬菌体是一种专门侵染细菌的病毒,当噬菌体颗粒的子代从被感染的
18、细胞中释放出来时,它就会杀死宿主细胞.噬菌体对细菌具有高度特异性,这减少了对菌群中有益菌和人的附带伤害.只要有宿主菌存在的自然环境中就可能提取到噬菌体.噬菌体因其特异性强、不良反应小、提取简单等优点,在医疗、食品安全、农业、水产、污水处理等行业也有很大的应用潜力 ,被作为替代抗生素治疗的重要选择之一.本研究拟采用双层琼脂法纯化培养大肠杆菌噬菌体(E s c h e r i c h i ac o l ip h a g e,E C P)和金黄色葡萄球菌噬菌体(S t a p h y l o c o c c u sa u r e u sp h a g e,S A P),利用电子显微镜观察其超微结构,
19、研究其最佳感染复数、一步生长曲线,以及对温度、p H、氯仿和紫外线的敏感程度,为进一步利用噬菌体控制、消除细菌感染及噬菌体制剂的研制提供一定的理论依据.材料与方法菌株和噬菌体来源E C P和S A P及其特异性宿主菌均由山东青岛诺安百特生物技术有限责任公司馈赠.主要试剂胰蛋白胨、酵母提取物均购自英国O X O I D公司,琼脂粉、聚乙二醇 购自北京索莱宝科技有限公司,S M缓冲液购自北京百奥莱博科技有限公司.噬菌体纯化用接种针在噬菌体平板上挑取单个大而透亮的噬斑,然后将其溶解于无菌S M缓冲液中,轻轻摇晃,置于冰箱中过夜,随后收集噬菌体上清液,使用 m孔径的细菌滤器过滤,滤液即为初始噬菌体纯化
20、液,将此噬菌体纯化液梯度稀释,双层平板培养,待长出噬斑后,挑取单个噬斑,继续梯度稀释,双层平板培养,连续重复上述操作次,直至在平板上观察到形态、大小比较均一的噬斑时,即得到纯化的噬菌体,将其保存于冰箱备用.噬菌体计数菌体效价是指每毫升试样中存在的侵染活性噬菌体粒子数,又称噬菌斑形成单位数(p l a q u e f o r m i n gu n i t,P F U),采用双层琼脂法进行计数,噬菌体效价计算公式为:效价(p f u/m L)噬斑数稀释倍数.噬菌体透射电镜观察在西安 交 通 大 学 医 学 部 电 镜 室,用 聚 乙 二 醇 纯化和浓缩的噬菌体,g/m L的磷钨酸对噬菌体浓缩样品进
21、行负染后,用透射电子显微镜进行观察拍照.根据其大小、尾部结构和头部结构进行了鉴定和分类.噬菌体最佳感染复数测定将宿 主 菌 悬 液 和 噬 菌 体 裂 解 液 按 感 染 复 数(m u l t i p l i c i t yo f i n f e c t i o n,MO I)分别为、的比例混匀,加入m LL B液体培养基,封口后放入 摇床振荡培养h,收集噬菌体上清液,用 m细菌滤器过滤,回收滤液,采用双层琼脂法测定各噬菌体样品效价,效价最高所对应的MO I值即为E C P和S A P的最佳MO I.一步生长曲线测定按最佳感染复数将噬菌体与宿主菌混合,摇床中 r/m i n振荡培养 m i
22、n,使E C P和S A P充分吸附在宿主菌上.,r/m i n,m i n离心噬菌体裂解液,弃掉上清,沉淀用 预热的m LL B液体培养基重悬,放入 ,r/m i n的恒温振荡培养箱中进行培养.在 m i n内间隔取样,每隔 m i n取次采用双层琼脂法测定E C P和S A P效价,以感染时间为横坐标,感染体系中E C P和S A P效价的对数值为纵坐标,分别绘制E C P和S A P一步生长曲线.期王香妮,马彩琴,刘进仁,等污水中分离的大肠杆菌噬菌体和金黄色葡萄球菌噬菌体的生物学特性分析本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学
23、学报医学版温度、p H敏感性测定将E C P和S A P稀释至合适效价(p f u/m L),分别取 L稀释后的E C P和S A P于试管中,将E C P和S A P各样品管放入不同温度和不同p H试管中,作用一定时间后,用双层琼脂法测定E C P和S A P效价,以作用温度、p H值为横坐标,以相应的E C P和S A P效价的对数值为纵坐标作图,根据E C P和S A P效价变 化 得 出E C P和S A P最 适 生 长 温 度 和p H范围.氯仿敏感性测定室温下 按 照 体 积 比 为 的 比 例,将 浓 度 为 p f u/m LE C P和S A P悬液分别与氯仿混合,摇晃m
24、i n使其充分混合,以 r/m i n离心m i n,室温静置待其重新分层;分别吸取 L上层E C P和S A P悬液,用L B液体培养基进行 倍系列稀释,不加氯仿的噬菌体设置为对照组,采用双层琼脂法测定E C P和S A P效价.紫外线敏感性测定取效价为 p f u/m L的E C P和S A P悬液,混合均匀后,分别吸取m LE C P和S A P悬液至孔板的中间孔内,立即放置于强度为 w/c m,功率和照射距离分别为 W和 c m的紫外灯正下方照射,分别于、m i n时取 LE C P和S A P悬液于相应的试管中,进行 倍梯度稀释,取适当稀释度的E C P和S A P悬液双层铺板测定效
25、价.最后以紫外线照射时间为横坐标,以所对应的E C P和S A P的杀灭对数值(K i l l i n g l o gv a l u e,K L V)为纵坐标作图,根据不同照射时间下,E C P和S A P的K L V得出E C P和S A P对紫外线的敏感性.K L V计算方法如公式():K L Vl o g N o l o g N x()n()式中:求和;l o g No 对照组中噬菌体效价的对数值;l o g Nx 实验组中噬菌体效价的对数值;n 实验次数.统计学处理采用S P S S 软件对紫外线灭活E C P和S A P的数据进行统计学分析,结果用“均数标准差”表示,选择单因素方差分
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