温里祛寒中药方剂抗寒活性成分筛选及药效学验证.pdf
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1、第 41 卷 第 4 期2023 年 8 月石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University(Natural Science)Vol.41 No.4Aug.2023收稿日期:2022-12-28 基金项目:国家自然科学基金项目(U1603122),新疆生产建设兵团创新领域中青年领军人才项目(2018CB019),四川省天府峨眉创新领军人才项目(1811)作者简介:卫贺(1996),男,硕士研究生,专业方向为药理学。通信作者:张波(1978),男,教授,从事系统药理学与中药药理学研究,e-mail:bozhang_lzu 。DOI:10.13880/ki.6
2、5-1174/n.2023.22.020文章编号:1007-7383(2023)04-0488-10温里祛寒中药方剂抗寒活性成分筛选及药效学验证卫贺1,苗艳丰1,张静1,李照雪1,王晓琴2,张波1,2(1 石河子大学药学院/新疆植物药资源利用教育部重点实验室,新疆 石河子 832003;2 成都大学药学院/四川抗菌素工业研究所,四川 成都 610106)摘要:目的 基于中医“治寒以热”辨证理论和温里祛寒方剂温中散寒的功效,对温里祛寒方中抗寒活性成分筛选并进行体外药效学验证。方法 基于大数据分析温里祛寒方剂药材分布特性;通过系统药理学方法进行活性成分的虚拟筛选和关键靶点的富集分析。建立体外 BC
3、PAP 细胞低温联合缺氧模型,通过代表成分的细胞活力及调控活性氧水平、抗凋亡/坏死情况进行体外药效学验证。结果 共收集到温里祛寒方剂 147 方,涉及中药材 153 味,药性主要为温/热、辛/苦,归脾肾肝经,具有生热、发散风寒之功效;药材中的化学成分主要参与细胞对外界物质及环境刺激的反应、体温调节等生物过程和 HIF-1 信号通路、细胞凋亡、甲状腺激素合成等信号通路的调节。体外药效学结果显示,代表成分阿魏酸、姜黄素、肉桂醛、6-姜酚、甘草苷能够有效抑制低温联合缺氧诱导 BCPAP 细胞活力的降低,改善细胞氧化应激水平和凋亡/坏死情况(P0.05)。分子对接结果显示活性成分与关键蛋白具有良好的结
4、合活性(结合能-5.0 kcal mol-1)。结论 温里祛寒方剂及其活性成分能够帮助机体应对低温刺激,其抗寒作用与改善包括甲状腺在内的神经内分泌系统损伤相关。关键词:温里祛寒方剂;大数据;成药性评价;抗寒;缺氧损伤;BCPAP 细胞;分子对接中图分类号:R285.1文献标志码:AScreening of anti-cold active components from Wenli Quhan Chinese medicine prescriptions and pharmacodynamic verification WEI He1,MIAO Yanfeng1,ZHANG Jing1,LI
5、Zhaoxue1,WANG Xiaoqin2,ZHANG Bo1,2(1 School of Pharmacy,Shihezi University/Key Laboratory of Xinjiang Endemic Phytomedicine Resources,Ministry of Education,Shihezi,Xinjiang 832003,China;2 School of Pharmacy,Chengdu University/Sichuan Antimicrobial Industry Research Institute,Chengdu,Sichuan 610106,C
6、hina)Abstract:Objective Based on the syndrome differentiation theory of treating cold by heat in Traditional Chinese Medicine(TCM)and the efficacy of warming interior for dispelling cold of Wenli Quhan Prescriptions,to screen the anti-cold active ingredients in tradi-tional Wenli Quhan Prescriptions
7、 and conduct the in vitro pharmacodynamic verification.Methods Based on big data,the distribution characteristics of medicinal materials in Wenli Quhan Prescriptions were analyzed.The virtual screening of active ingredients and en-richment analysis of key targets were performed by systematic pharmac
8、ology.The BCPAP cell model of low temperature combined with hypoxia was established in vitro,and pharmacodynamic verification was performed through the effect of representative components on cell viability and regulation of reactive oxygen species and anti-apoptosis/necrosis levels.Results A total o
9、f 147 Wenli Quhan Prescrip-tions were collected,involving 153 Chinese herbal materials.The herbal properties are mainly warm and hot,pungent and bitter,which mainly enter the spleen meridian,kidney meridian and liver meridian,and had the effects of generating heat and dispersing it.The chemical comp
10、onents in high-frequency herbal materials are mainly involved in the cellular responses to external substances and environmental stimuli,temperature regulation and other biological processes,and the regulation of HIF-1 signaling pathway,apopto-sis,thyroid hormone synthesis and other signaling pathwa
11、ys.In vitro pharmacodynamic evaluation results showed that ferulic acid,cur-cumin,cinnamaldehyde,6-gingerol,and liquiritin could effectively inhibit the decrease in cell viability of BCPAP induced by low-第 4 期卫贺,等:温里祛寒中药方剂抗寒活性成分筛选及药效学验证489 temperature combined with hypoxia(P0.05),and reduce the cell
12、 oxidative stress and apoptosis/necrosis level.Molecular docking results showed that the active components had a good binding activity with key proteins(Binding Energy-5.0 kcal mol-1).Conclu-sion Wenli Quhan Prescriptions and their active components can help the body to cope with low-temperature sti
13、mulation,and their anti-cold effect is related to alleviating the damage of the neuroendocrine system,including thyroid gland.Key words:Wenli Quhan prescription;big data;evaluation of medicinal properties;anti-cold;hypoxic injury;BCPAP cells;molecular docking机体长期处于寒冷环境会引起的低温损害1。中医认为体内阳气不足易气血运行不畅,寒邪入
14、六经五脏而致里寒证,轻则气血凝滞,脾胃不行,重则心悸怔忡、亡阳欲脱等2。在内经“寒者热之”、“治寒以热”的正治治则指导下,中医采用温里祛寒药来预防或治疗寒症,如干姜、附子、细辛、吴茱萸等温热药材及大青龙汤、栀子干姜汤、理中汤、四逆汤、甘草干姜汤等温里祛寒方剂2,具有温里助阳、散寒通脉等功效3。常见的方剂包括桂枝人参汤、麻黄附子细辛汤、理中汤、干姜甘草汤、桂枝甘草汤、当归四逆汤、吴茱萸汤、真武汤等2。但主要物质基础和机制尚未系统研究,低温医学防护方面应用受限。甲状腺为后天之阳,其分泌的甲状腺激素作用于外周器官和中枢自主神经通路,在保持体温方面发挥着重要作用4。因此温里祛寒方发挥“温里”作用也可能
15、与甲状腺相关。而在寒冷环境中,甲状腺会因低温、缺氧发生损伤,造成功能紊乱,失去升阳作用,进一步加重冷冻损伤增加死亡率5-6。先前的研究发现低温暴露下小鼠的甲状腺组织形态发生改变,滤泡出现破裂、消融,缺氧处理也会诱导BCPAP 细胞(人甲状腺癌乳头状细胞)发生氧化应激和凋亡,而温里药干姜及其活性成分 6-姜酚、姜黄素能够缓解甲状腺组织、细胞的损伤并增强甲状腺功能,提高体温,发挥“温里祛寒”作用7-8。这提示温里祛寒药物抗寒作用可能与甲状腺保护相关。为进一步明确温里祛寒方剂抗寒的物质基础和作用机制,使之更好地应用于临床,本文基于中医辨证理论和药性理论,从传统温里祛寒方剂入手,利用系统药理学和体外实
16、验进行温里祛寒药物抗寒研究,以期明确温里祛寒方剂抗寒的物质基础及作用机制。1 材料与方法1.1材料姜黄素(HPLC98%,批号:114G025)和阿魏酸(HPLC98%,批号:1106H022)购自北京索莱宝科技 有 限 公 司,肉 桂 醛(HPLC 95%,批 号:B16N10C102990),6-姜 酚(HPLC 98%,批 号:P15J11F118583)、甘 草 苷(HPLC 98%,批 号Z13J11X108109)和 噻 唑 蓝(HPLC 98%,批 号:J11HS184377)购自上海源叶生物科技有限公司,连二亚硫酸钠(Na2S2O4)购自天津市福晨化学试剂厂,PI 染液(批号
17、10642)购自杭州联科生物技术股份有限公司,DAPI 染液和 DHR123 染液购自北京索莱宝科技有限公司,二甲基亚砜(DMSO)购自 Sig-ma-Aldrich,RPMI 1640 培 养 基 和 磷 酸 盐 缓 冲 液(PBS)购自 Gibco 公司,胎牛血清(FBS)购自 Bio-logical Industries。1.2方法1.2.1温里祛寒方剂收集与药材药性分析以“温里祛寒”为关键词通过药智数据库(ht-tps:/ 10 味药材,结合中国药典明确其药性和主要成分。1.2.2高频药材化学成分成药性分析通过 TCMSP 和 TCMID 数据库获取关键药材的化学成分,并使用 ADME
18、T Predictor 9.5 软件按吸收评价(Absn_Risk)3.5,代谢评价(CYP_Risk)2.5,毒 性 评 价(TOX _ Risk)2.0,致 突 变 评 价(MUT_Risk)1.0,综合评价(ADMET_Risk)7.5,对化学成分进行成药性评价及筛选,得到活性成分7。之后利 PharmMapper 网络服务器(http:/www.lilab- SwissTarget-Prediction 数据库(http:/www.swisstargetprediction.ch/)获取活性成分潜在靶点7。1.2.3温里祛寒活性成分抗寒潜在靶点预测和蛋白-蛋白互作分析在 GeneCar
19、ds 数据库(https:/www.genecards.org)中以“cold stress”和“cold shock”为关键词进行检索获得寒冷损伤相关的基因,选取 Relevance score 10 的基因与活性成分潜在靶点取交集7。对交集基因利用 String 数据库(https:/string-db.490 石河子大学学报(自然科学版)第 41 卷org/)构 建 蛋 白-蛋 白 互 作 关 系,并 利 用 以 Cyto-scap3.7.2 软件呈现相互关系网络7。1.2.4靶点生物信息学分析通 过 DAVID 数 据 库(https:/david.ncifcrf.gov/)对关键靶点
20、进行组织分布、生物过程和信号通路富集分析,之后利用微生信(http:/www.bioinfor- PubChem(https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中检索小分子结构,优化并使用 Chem3D 保存11。接下来,从蛋白质数据库(PDB)数据库(ht-tps:/www.rcsb.org/structure/)下载目标蛋白质的晶 体 结 构11。利 用 PlayMolecule(https:/ Autodock 1.5.7 和 Discovery Studio 2017 R2 Client 软件进行分子对接及可视化处理11。1.2.6BCPAP 细胞培养将 BCPAP
21、 细胞培养在含有 10%胎牛血清,100 U mL-1青霉素和 100 gmL-1链霉素的 RP-MI1640 培养基中,置于含有 5%CO2,37 的湿润培养箱中培养。1.2.7细胞模型建立为模拟低温环境下细胞对低温和缺氧的环境,本研究采用外界低温处理联合糖氧剥夺的方法诱导细胞损伤12。用 PBS 清洗 3 次细胞后,加入含 0、2、4、8 mmolL-1 Na2S2O4的无糖培养基,用封口膜密封后放入到 32 培养箱中继续培养 4 h,加入 10 L 5 mg mL-1 MTT 溶液并孵育 4 h。将所得的甲瓒结晶溶于 150 L 二甲基亚砜,然后将板子置于振荡器上振荡 10 min,在
22、570 nm 下用酶标仪测定吸光度,根据细胞活力确定造模剂量。1.2.8细胞给药及活力检测将细胞随机分为正常组、模型组、FA(阿魏酸)组(5、10、20、40、80 mol L-1)、CUR(姜黄素)组(2、4、8、16、32 molL-1)、CA(肉桂醛)组(5、10、20、40、80 mol L-1)、6-GIN(6-姜酚)组(5、10、20、40、80 molL-1)、LIQ(甘草苷)组(5、10、20、40、80 mol L-1)。将指数生长的细胞以每孔 8103 个的密度接种于 96 孔板中过夜,对照组和模型组加入100 L 不含血清的培养基,其他给药组加入含不同浓度药物的不含血清培
23、养基,预处理 24 h。之后吸走各组细胞中的培养基,PBS 清洗 3 次后,对照组加入 100 L 不含血清培养基,放入 37 培养箱中培养;模型组和各给药组细胞加入 100 L 含 Na2S2O4的不含血清的无糖培养基,置于 32 培养箱中培养。4 h 后,加入 MTT 测定细胞活力,方法同 1.2.7。1.2.9细胞内活性氧水平检测使用 DHR123(二氢罗丹明 123)评估 BCPAP细胞活性氧(ROS)的产生13。将指数生长的细胞以每孔 5105 个的密度接种于 6 孔板中过夜,经药物保护及造模处理,用 PBS 洗 3 次,向各孔细胞中加入 l mL 含 5 gmL-1 DHR123
24、的 PBS 并孵育 20 min,使 用 荧 光 显 微 镜(Axio Observer A1,ZEISS,Germany)观察细胞 ROS 产生情况。1.2.10细胞凋亡/坏死情况检测使用 DAPI/PI(4,6-联脒-2-苯基吲哚/碘化丙啶)评估 BCPAP 细胞凋亡/坏死情况14。将指数生长的细胞以每孔 5105 个的密度接种于 6 孔板中过夜,经药物保护及造模处理,用 PBS 洗 3 次,向各孔细胞中加入 l mL 含 5 gmL-1 DAPI 和 PI 的 PBS并孵育 20 min,使用荧光显微镜(Axio Observer A1,ZEISS,Germany)观察细胞死亡情况。1.
25、2.11统计学方法采用 SPSS 20.0,GraphPadPrism 8.0.统计软件进行分析,所有数据以XS 表示,两组间比较采用 t检验,3 组及以上比较采用单因素方差分析15。2 结果2.1温里祛寒方剂数据库的构建和关键药材筛选通过药智数据库、医学百科数据库以及文献检索收集到温里祛寒方剂 147 个,涉及 153 味中药材,其中出现频次 TOP 10 的药材分别为甘草(炙)、干姜、附子、桂枝、人参、当归、白术、半夏、生姜、肉桂,见图 1c。通过对药材的药性、功效分析发现,温里祛寒方剂中的药材药性多为温或热性,药味多为辛、苦、甘,具有温热、发散等功效,能够进入脾、肝、肾、肺、胃等内脏,发
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