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无乳链球菌感染卵形鲳鲹脾脏转录组学分析.pdf
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1、Vol.9 No.3Jun.2023生物化工Biological Chemical Engineering第 9 卷 第 3 期2023 年 6 月文章编号:2096-0387(2023)03-06无乳链球菌感染卵形鲳鲹脾脏转录组学分析卞泽昌1,陈健安2,王亚丹2,黄壮2,杜春民2,蔡小辉2,胥鹏2*,关杰耀1,2(1.广西大学 动物科学技术学院 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,广西南宁 530004;2.北部湾大学 海洋学院 广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室,广西钦州 535011)摘 要:无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是卵形鲳鲹(Trach
2、inotus ovatus)的主要病原之一,可造成严重的经济损失。为探索卵形鲳鲹感染无乳链球菌后的分子机制,本研究通过转录组测序(RNA-seq)术获得卵形鲳鲹脾脏转录组图谱进行分析。结果显示,感染 6 h 和 24 h 脾脏中分别鉴定出 4 749 个和 8 651 个差异表达基因(DEGs)。GO 分析表明,DEGs 主要分布在不同的 GO 条目中。KEGG 富集分析发现,38 条信号通路分别在两个时间点显著富集。趋势分析结果发现,DEGs 具有时间特异性,并形成 4 种与感染时间密切相关的不同表达谱。针对趋势分析的 KEGG 富集分析表明,DEGs 在产生 IgA 的肠道免疫网络、Th1
3、和 Th2 细胞分化、白细胞经内皮迁移、造血细胞谱系、Th17 细胞分化、T 细胞受体信号通路和胞质 DNA 传感途径等免疫途径上富集,其中 6 条通路显著下调,1 条通路显著上调,说明大多数免疫相关基因受到抑制,只有少数免疫相关基因受到上调。表明无乳链球菌可能抑制大多数免疫相关基因和免疫相关通路,只有上调的免疫相关基因和通路才可能在宿主抵抗外来细菌入侵的免疫防御中发挥作用。这些研究结果为卵形鲳鲹无乳链球菌感染的免疫防御机制提供了新的见解。关键词:卵形鲳鲹;无乳链球菌;免疫基因;信号通路;趋势分析中图分类号:S941.42 文献标识码:ATranscriptomicAnalysisoftheS
4、pleenofTrachinotus ovatusInfectedwithStreptococcus agalactiaeBIAN Zechang1,TAN Kian Ann2,WANG Yadan2,HUANG Zhuang2,DU Chunmin2,CAI Xiaohui2,XU Peng2*,KWAN Kit Yue1,2(1.State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropicalagro-Bioresources,Animal Science and Technology College,Guangxi
5、University,Nanning 530004,China;2.Guangxi Key Laboratory of Beibu Gulf Marine Biodiversity Conservation,Marine College,Beibu Gulf University,Qinzhou 535011,China)Abstract:Streptococcus agalactiae is one of the main pathogens of T.ovatus,which can cause serious economic losses.To explore the molecula
6、r mechanism of T.ovatus infected by S.agalactiae,the splenic transcriptome of T.ovatus is obtained by RNA sequencing(RNA-seq)technique.The results show that 4 749 and 8 651 Differentialy Expressed Genes(DEGs)are identified in spleen at infected for 6 h and 24 h,respectively.GO analysis show that DEG
7、s are mainly distributed in different GO projects.KEGG enrichment analysis show that 38 signaling pathways are significantly enriched at two time.Trend analysis show that DEGs is time-specific and form four different expression profiles closely related to infection time.KEGG enrichment analysis for
8、trend analysis show that the DEGs are enriched on the immune pathways like intestinal immune network for IgA production,Th1 and Th2 cell differentiation,leukocyte transendothelial migration,hematopoietic cell lineage,Th17 cell differentiatio,T cell receptor signaling pathway and cytosolic DNA-基金项目:广
9、西科技基地和人才专项(桂科 AD19245059);广西自然科学基金项目(2019GXNSFBA245062);北部湾大学高层次人才科研启动项目(2019KYQD15);广西高校中青年教师科研基础能力提升项目(2019KY0464)。作者简介:卞泽昌(1996),男,安徽滁州人,硕士在读,研究方向为水生动物疫病防控。通信作者:胥鹏(1989),男,甘肃天水人,博士,讲师,研究方向为水产动物免疫学。E-mail:。18生物化工2023 年卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)因肉质鲜美、繁殖周期短、经济价值高而在中国被广泛养殖。但近年来,随着卵形鲳鲹养殖规模的不断扩大,病害频繁暴发,链
10、球菌病就是其中之一1。链球菌病的频繁发生给世界各地的养鱼业造成了严重的经济损失2-4,受链球菌影响的鱼类包括牙鲆(Paralichthys olivaceus)5、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)6、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)7、卵形鲳鲹3和观赏鱼3,8等,感染链球菌的鱼通常表现出非常相似的症状,如眼球突出、游泳异常、脑膜炎和内脏出血等2-3。无乳链球菌作为链球菌中的一种,不仅会影响哺乳动物9,还会对鱼类造成感染,如齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)10、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)11和 尖吻
11、鲈(Lates calcarifer)12等。研究显示无乳链球菌引起的疾病可造成卵形鲳鲹的高死亡率,严重阻碍卵形鲳鲹养殖产业的快速发展3。利用分子生物学技术研究卵形鲳鲹感染无乳链球菌后的免疫应答机制是至关重要的。转录组测序(RNA-seq)作为一种快速、方便的基因组研究方法,可以识别许多功能基因和分子标记13,近年来已发展成为研究鱼类病毒性和细菌性疾病发病机制的有力工具。例如,利用 RNA-seq 技术检测了牙鲆淋巴囊肿病毒、病毒性出血败血症和细胞肿大病毒引起的免疫应答和感染13-14,以及通过 RNA-seq 分析罗非鱼和斑马鱼感染无乳链球菌后的免疫反应11,15等。本研究通过给健康的卵形鲳
12、鲹腹腔注射无乳链球菌进行攻毒,然后对卵形鲳鲹脾脏进行 RNA 测序。构建测序数据库后进行分析,利用GO 和 KEGG 富集分析对差异表达基因(DEGs)和信号通路进行富集分析,并通过 STEM 软件分析,确定DEGs 的表达趋势。本研究为进一步筛选和研究卵形鲳鲹无乳链球菌感染后的免疫相关基因和通路提供了理论依据。1 材料与方法1.1 实验鱼和菌株36条健康的卵形鲳鲹购自广西钦州市犀牛角镇鸿钰水产科技有限公司,体重为(500.7)g。并将其置于 200 L 水箱中用处理过的海水在 28 30 下适应10 d。无乳链球菌由北部湾大学蔡小辉副教授惠赠。1.2 试剂与仪器TRNzol Universa
13、l 总 RNA 提取试剂(100 mL),北京天根生化科技有限公司;脑心浸出液肉汤(BHI)(250 g),北京索莱宝科技有限公司;琼脂粉(250 g),上海生工生物工程股份有限公司;无水乙醇、氯仿,分析纯,成都科龙化工试剂有限公司;NaoDrop2000 核酸浓度检测仪,美国 Thermo Scientific 公司;DYY-6C凝胶电泳仪,北京六一生物科技有限公司;GDBL-1000 凝胶成像仪,美国 Axygen 公司;THZ-92CS 气浴恒温振荡器,杭州川恒实验仪器有限公司;2-16KL台式低温离心机,德国 Sigma 公司。1.3 细菌培养及组织采集将实验菌株无菌接种到 BHI 固
14、体培养基中过夜,然后挑取单克隆至 10 mL BHI 液体培养基中,在 37 下以 200 r/min 振荡孵育过夜,最后在 50 mL BHI液体培养基中按 1 100(菌液液体培养基)体积比例继续在 37 下以 200 r/min 振荡孵育 10 h。4 离心收集细菌菌体,用 PBS 缓冲液(pH=7.4)重悬,通过梯度稀释法将重悬菌液稀释 106倍,最后使用平板计数法进行计数。将 36 条鱼分为 0 h(对照组,C)、6 h(实验组,W6)和 24 h(实验组,W24)3 组,每组包含 12 条鱼;对照组腹腔注射 100 L PBS 缓冲液(pH=7.4),W6 组与 W24 组腹腔注射
15、 100 L 1107 CFU/mL 无乳链球菌悬液。注射后 0 h、6 h 和 24 h 收集每组 9条鱼的脾脏,每3个脾脏混合成一个样品并标明名称,置于-80 保存至 RNA 提取过程。sensing pathway,in which six of them are down-regulated and one is up-regulated.This indicates that most immune-related genes are suppressed and only a few are upregulated.The findings suggest that S.agala
16、ctiae may inhibit most immune-related genes and immune-related pathways,and only up-regulated immune-related genes and pathways may play a role in host immune defense against foreign bacterial invasion.Taken together,this study provides novel insights into the immune defense of T.ovatus against S.ag
17、alactiae infection.Keywords:Trachinotus ovatus;Streptococcus agalactiae;immune gene;signaling pathway;trend analysis第 3 期19卞泽昌等:无乳链球菌感染卵形鲳鲹脾脏转录组学分析1.4 RNA 提取、文库构建和测序使用 Trizol 提取总 RNA,通过琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度检测仪评估 RNA 完整性和浓度,之后构建cDNA 文库,送往广州基迪奥生物科技有限公司测序。1.5 组装和注释为了保证数据质量,对测序结果进行数据过滤,以减少无效数据所带来的分析干扰,首先利用 fastp
18、对 raw reads 过滤低质量数据得到 clean reads,再通过Trinity 软件进行组装获得 unigenes。将获得的 unigenes通过Nr数据库、Swiss-Prot蛋白数据库、KEGG数据库、GO 数据库、COG/KOG 数据库进行注释。1.6 差异表达基因分析方法使用 DESeq2 软件分析 3 个不同组之间的差异表达(并在两个样本之间使用 edgeR)。以错误发现率(FDR)0.05 和绝对折叠变化 2 为参数,判断存在差异表达的基因。基于 Wallenius 非中心超几何分布,GOseq 包对差异表达基因进行 GO 富集分析。通过 KEGG 显著富集分析找出基因显
19、著富集的通路,通过通路显著富集确定基因参与的最主要生化代谢通路和信号转导通路。1.7 趋势分析为检验 DEGs 的表达模式,先将每个样本的表达数据归一化为 0、log2(v1/v0)、log2(v2/v0),再通过 STEM 软件进行聚类。随后,对所有图谱中的DEGs 进行 GO 和 KEGG 富集分析。通过显著性分析和 FDR 校正假设检验,将 Q 值 0.05 的 GO 条目或通路分类为显著富集的 GO 条目或通路。2 结果与分析2.1 RNA 测序和功能注释测序结果显示,raw reads 经过过滤后,所有clean reads 被组装成 72 857 个 unigenes,其中平均长度
20、和 N50 分别为 1 121 bp 和 2 553 bp。通过主要功能数据库(NR、KOG/COG、Swiss-Prot 和 KEGG)共对 72 857 个 unigenes 进行了注释,获得结果分别为 25 089 个(占 34.56%)、23 324 个(占 32.01%)、18 500 个(占 25.39%)和 14 712 个(占 20.19%)unigenes。通过 DESeq2 分析共发现了 10 014 个 DEGs。相较于对照组,6 h 中发现了 4 749 个 DEGs,其中上调和下调 DEGs 分别为 1 812 和 2 937 个(图 1a);24 h 中共发现 8
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