微纳米无定形碳酸钙的微生物诱导矿化机制.pdf
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1、井冈山大学学报(自然科学版)45文章编号:1674-8085(2023)04-0045-09微纳米无定形碳酸钙的微生物诱导矿化机制6龙 超1,3,周舒月1,付海云1,柳 艳1,鄢晓坤1,尹 丽1,2,*刘仁绿1,2,*贺根和1,2(1.井冈山大学生命科学学院,江西,吉安343009;2.江西省红壤丘陵区农业环境污染防控重点实验室,江西,吉安343009;3.江西理工大学土木与测绘工程学院,江西,赣州341000)摘要:以地衣芽孢杆菌为研究菌株,将菌株接种于含Ca2+的LB培养基中培养0 10 d,通过分析培养液OD600 nm、pH值、Ca2+的动态变化,同时借助SEM-EDS、TEM-SAE
2、D、XRD等手段分析所得沉淀物的形貌及结构特征,以期解析该菌对无定形碳酸钙的微生物诱导矿化机制。结果表明,地衣芽孢杆菌的快速生长能显著提升培养液的pH值,相比起始pH值提高了1.63个单位(P 0.05),Ca2+浓度随培养时间的增加有显著下降的趋势,Ca2+浓度最大减少了516.48 mg/L(P 0.01);SEM可观察到培养液中的沉淀物中有许多无规则的微纳米级矿物,EDS结果表明其主要元素为C、O、Ca,可见地衣芽孢杆菌可诱导碳酸钙的形成。TEM-SAED及XRD的结果证实这些生物源碳酸钙为无定形碳酸钙。研究还发现通过添加碳酸酐酶抑制剂能显著减弱该菌对碳酸钙的诱导矿化能力,这些生物源碳酸
3、钙的形成与该菌分泌的碳酸酐酶活性密切相关,并且菌体细胞还可以作为碳酸钙的成核位点。碳酸钙沉淀无机碳同位素13C值是-5.762 0.022,13C值为负值,也进一步证实了这些无定形碳酸钙沉淀为生物成因。该研究结果有助于加深对生物源无定形碳酸钙的了解,进一步阐明了微纳米无定形碳酸钙的微生物诱导矿化机制,可为生物源无定形碳酸钙的进一步开发应用提供重要参考。关键词:地衣芽孢杆菌;无定形碳酸钙;生物成矿;机制中图分类号:Q939.96文献标志码:ADOI:10.3969/j.issn.1674-8085.2023.04.008MECHANISM OF MICRO-NANOAMORPHOUS CALCI
4、UM CARBONATEMINERALIZATION INDUCED BY MICROBELONG Chao1,3,ZHOU Shu-yue1,FU Hai-yun1,LIU Yan1,YAN Xiao-kun1,YIN Li1,2,*LIU Ren-lu1,2,*HE Gen-he1,2(1.School of Life Sciences,Jinggangshan University,Jian,Jiangxi 343009,China;2.Key Laboratory of Jiangxi Province for Agricultural Environmental Pollution
5、Prevention and Control in Red Soil Hilly Region,Jian,Jiangxi 343009,China;3.School of Civil Engineering and Surveying and Mapping Engineering,Jiangxi University of Science and Technology,Ganzhou,Jiangxi 341000,China)Abstract:In this paper,Bacillus licheniformis was used as the research strain.The st
6、rain was inoculated in LBmedium(containing Ca2+)culture for 0 to 10 days.The dynamic changes of OD600nm,pH value and Ca2+concentration in the culture medium were analyzed.At the same time,the morphology and structuralcharacteristics of the precipitate were analyzed by SEM-EDS,TEM-SAED and XRD,etc.,i
7、n order to clarify themechanism of amorphous calcium carbonate mineralization induced by microbe.The results showed that the rapidgrowth of B.licheniformis could significantly increase the pH value of the culture medium,which was 1.63 unitshigher than the initial pH value(P 0.05).The concentrations
8、of Ca2+decreased significantly with the increase ofculture time,and the maximum concentration of Ca2+decreased by 516.48 mg/L(P 0.01);There are manyirregular micro-nano minerals in the sediment of the culture solution by SEM,EDS results show that the main收稿日期:2023-02-12;修改日期:2023-03-26基金项目:国家自然科学基金项
9、目(42102344,41867032);江西省教育厅科技计划项目(GJJ211020,GJJ201034);江西省博士后科研择优资助项目(2021KY41);江西省红壤丘陵区农业环境污染防控重点实验室开放基金资助项目(JXKL2021006);吉安市科技局重点项目(20211-055456);大学生创新创业训练计划项目作者简介:*刘仁绿(1989-),男,江西吉安人,讲师,博士,主要从事地质与环境微生物学的教学与研究(E-mail:);*贺根和(1977-),男,江西永丰人,教授,博士,主要从事环境生物学的教学与研究(E-mail:).第44卷第4期Vol.44 No.4井冈山大学学报(自然
10、科学版)2023年7月Jul.2023Journal of Jinggangshan University(Natural Science)45井冈山大学学报(自然科学版)46elements are C,O,Ca,which shows that B.licheniformis can induce the formation of calcium carbonate.Theresults of TEM-SAED and XRD show that the biogenic calcium carbonate is amorphous calcium carbonate.Inaddition
11、,it is found that the addition of carbonic anhydrase(CA)inhibitor can significantly reduce the ability ofthe bacteria to induce the mineralization of calcium carbonate,indicating that the formation of these biogeniccalcium carbonate is closely related to the CA activity secreted by the bacteria,and
12、the bacterial cell can also beused as a nucleation site.Inorganic carbon isotope 13C value of calcium carbonate is-5.762 0.022,whichfurther confirms that the amorphous calcium carbonate precipitates are biogenic.The research results in this paperhave greatly enriched our insights of biogenic amorpho
13、us calcium carbonate,further clarified the mechanism ofmicrobial induced mineralization of micro-nano amorphous calcium carbonate,and provided theoretical basis forthe further development and application of biogenic amorphous calcium carbonate.Key words:Bacillus licheniformis;amorphous calcium carbo
14、nate;biomineralization;mechanism在环境中广泛存在微生物的诱导矿化作用,几乎每一种微生物都能诱导矿物的合成1。微生物矿化常见的反应类型主要包括反硝化反应、尿素水解作用、铁还原反应、硫酸盐还原反应等2,不同的生境下,微生物诱导矿化的产物各异3-6。近年来,人们对生物矿化过程产物多样性的认识更为深入,在漫长的地质演化中,生物圈的理化特性因生物矿化过程而发生了很大变化7。与无机化学成矿过程相比,生物诱导的碳酸钙矿物晶体多为纳米级,晶型多样且微量元素成分更为复杂8-9。许多微生物,如藻类、真菌以及细菌类都有诱导碳酸钙沉积的功能10-11。LianB等8利用巨大芽孢杆菌(B
15、acillusmegaterium),HouW等12利用链格孢菌(Alternaria sp.),Han J等13利用蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),Heim C等14利用巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii),Ramanan R等15利用小球藻(Chlorella sp.)及钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)都能成功诱导出碳酸钙的形成。李辉等16以磷灰石作为唯一钙源和磷源条件下,实验中利用胶质类芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)在风化磷灰石的同时可诱导碳酸钙的生成。Hou W等12研究了一株土壤真菌-链格孢菌(Al
16、etnaria sp.),发现该菌可以利用Ca(NO3)2作为氮源,通过硝酸盐还原酶和亚硝酸还原酶把硝酸根还原为氨根,使培养基pH值升高,同时利用培养基中的Ca2+和真菌呼吸作用释放的CO2或大气中的CO2产生的HCO3进而诱导碳酸钙的形成。由于碳酸钙形成会导致大气CO2的沉积,可减少水体及土壤中CO2的排放,这无疑对大气CO2浓度的减少和温室效应的延缓起到很好的作用17-19。此外碳酸钙的微生物诱导矿化作用还可应用于固化土壤、固持污染物、修复混凝土裂缝、制作水泥等20-21,因此研究碳酸钙矿物的微生物诱导矿化机制具有重要的价值及意义。已知的碳酸钙主要有方解石、六水方解石、一水方解石、半水合碳
17、酸钙、无定形碳酸钙、文石以及球霰石,其中方解石是常温常压下最稳定的结构形式20,22-25。微生物菌体细胞或其碎片、代谢产物及其周围的营养等环境条件都会显著地影响碳酸钙生成的表面形貌特征3,8,26。微生物不仅能够诱导碳酸盐矿物的形成,还能够调控碳酸盐矿物的构形8,18。在自然环境中,相对于方解石和文石,无定形碳酸钙很少出现27。无定形碳酸钙(ACC)在环境中非常不稳定很容易转变为更加稳定的方解石28。要想得到稳定的ACC往往需要加入化学稳定试剂,如:Cai G B,等29通过加入聚丙烯酸合成了稳定的ACC纳米颗粒,并且该ACC颗粒对重金属离子(Cd2+、Cr3+、井冈山大学学报(自然科学版)
18、47Pb2+、Ni2+、Fe3+)具有很好的吸附效果。然而该ACC的制备方法需要加入大量的ACC稳定剂聚丙烯酸,其制备成本高,环境不友好,无法大规模推广使用。然而已有研究表明环境中的部分微生物可以诱导形成稳定的无定形碳酸钙30,因此探讨无定形碳酸钙的微生物诱导矿化机制对于该生物源矿物的开发与应用具有重要意义和价值。微生物在生长过程中分泌的代谢产物对于碳酸盐的形成和生长具有重要影响,如微生物分泌的胞外多糖有利于碳酸盐晶体的生长,微生物的代谢活动还可以改变周边pH环境,从而影响碳酸盐等矿物的合成和溶解7,9,31-33。但总体来说,微生物诱导无定形碳酸钙合成的机制和微观过程仍不清楚,很多结论也缺乏
19、足够的证据,这极大限制了生物源无定形碳酸钙的进一步开发及应用。近年来,受我国农业农村部“化学农药减量化行动方案”的推动,微生物肥料产业发展迅猛,地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)因能有效促进多种作物生长而被广泛应用于各种微生物肥料产品中7,9,31-33。显然研究地衣芽孢杆菌对碳酸钙的诱导矿化机制对阐明由该菌制作的菌肥产品促进土壤碳素循环的功能有重要价值。前期课题组成员在对该菌的培养研究中发现了微纳米级无定形碳酸钙的大量合成,而该菌诱导无定形碳酸钙矿化机制的研究还未见相关报道。本研究以地衣芽孢杆菌为实验菌株,旨在阐明该菌株在以CaCl2为钙源的条件下诱导的微纳米级无定
20、形碳酸钙矿化的动态过程及机制,以期为生物源无定形碳酸钙的进一步开发与应用提供理论基础。1材料与方法1.1菌株及菌种液的制备实验菌株:地衣芽孢杆菌(Bacilus licheniformis)LRL007(CGMCC No.24275)分离自赣南稀土矿区堆浸场土壤,并于2022年1月保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。该菌是一种公认的安全无毒的革兰氏阳性菌,适宜在中性及偏碱性环境下繁殖生长,在培养过程中会散发出明显的臭味;菌落呈圆形,乳白色或淡黄色、表面不光滑,边缘不整齐,菌落松散,镜检菌株为直杆状,两端呈圆形。菌种液的制备:采用接种环挑取1-2环地衣芽孢杆菌于已灭菌的100 mL LB液体培
21、养基(胰蛋白胨1 g、NaCl 1 g、酵母提取物0.5 g,pH=6.57.5)中;过夜培养(30,180 rpm,10 12 h),即可制得菌种液(3.85 0.49)108cfu/mL。1.2碳酸钙微生物诱导矿化过程相关指标的测定实验中加入100mL已灭菌(115灭菌30min)LB液体培养基(含CaCl20.2 g)到250 mL锥形瓶。灭菌结束后实验组(E组)接入2 mL菌种液进行碳酸钙的微生物诱导矿化,对照组(C组)则接入2 mL灭活菌种液,每组设置3个平行,所有组置于的摇床(180 r/min、30)中培养0 10 d。每隔24h取培养液测得OD600nm值后于8000r/min
22、进行离心15 min。取上清液用于pH值(pH计,SevenEasy S20)及Ca2+浓度(AAS,AA-6300CF)的测定。1.3沉淀物的形貌观察及矿物结构分析培养7 d后收集E组中离心所得沉淀物于55烘干,玛瑙研磨过100目筛后用于扫描电子显微镜-能谱分析(Scanning electron microscope-Energy Dispersive Spectrometer,SEM-EDS,Mira4,Tescan)观察其形貌特征及元素组成,采用X射线 衍 射(X-ray diffraction,XRD,Ultima IVmultipurpose)及 透 射 电 镜-电 子 选 区 衍
23、 射(Transmission electron microscope-Selected areaelectron diffraction,TEM-SAED,Tecnai G2 F20 S-TWIN)分析其矿物结构特征。井冈山大学学报(自然科学版)481.4碳酸酐酶的作用及碳同位素13C值的测定为了进一步明确碳酸酐酶(Carbonic anhydrase,CA)在碳酸钙诱导成矿中的作用,实验体系分成两 组,即CA抑 制 组(CA抑 制 剂 乙 酰 唑 胺(Acetazolamide,AZ)终浓度为2 mg/mL)和CA未受抑制组(未添加CA抑制剂AZ),按照2%的量添加地衣芽孢杆菌菌种液,同时
24、以未添加菌种液的三角瓶为对照组。培养7 d后测定上清培养液中Ca2+的浓度,忽略菌株吸收利用的Ca2+,绝大部分Ca2+会转化为碳酸钙,进而可求得Ca2+的矿化率(公式1)。同时采用碳同位素13C值来判别实验组所形成碳酸钙是否为生物成因。收集CA未受抑制组的沉淀物,用磷酸将沉淀物中的无机碳转化为CO2气体,分别收集该CO2气体,用气体质谱仪(Finnigan MAT252,德国)测定稳定碳同位素组成12-13。Ca2+的矿化率(%)121CCC100(1)C1为对照组Ca2+浓度,C2为实验组Ca2+浓度。1.5数据统计分析实验数据采用SPSS(V20)分析,所有实验结果均以三个重复实验数据的
25、平均值标准偏差形式呈现。利用t检验或单因素方差分析,Duncan多重比较检验来确定不同处理组间差异的显著性(*P0.05或*P0.01)。2结果2.1细菌生物量及pH值随时间的变化地衣芽孢杆菌在培养基中生长迅速,在生长的第2 d其OD600nm值就达到最高值1.43(图1 a),培养液pH增加的原因是该菌的快速生长导致的。实验组细菌培养液pH值在第2 d上升至8.17,第4 d上升至8.78,达到最高值,相比起始值提高了1.63个单位(P 0.05),而未接菌的对照组pH值几乎没有变化,始终保持在7.15左右(图1 b)。时间/d时间/d图1 OD600nm(a)及pH(b)值随时间的动态变化
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