人参茎叶中人参皂甙含量检测前处理工艺优化及方法学考察.pdf
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1、第 9 卷 第 4 期2023 年 8 月生物化工Biological Chemical EngineeringVol.9 No.4Aug.2023文章编号:2096-0387(2023)04-05人参茎叶中人参皂甙含量检测前处理工艺优化 及方法学考察杨景霞,刘凯华,毛华,张良明*,杨阳(西安天一生物技术股份有限公司,陕西西安 710000)摘 要:目的:优化人参茎叶中人参皂甙含量检测前处理的最佳工艺,确定人参茎叶原料中的人参皂甙含量检测方法并进行方法学考察。方法:采用正交实验优化人参茎叶中人参皂甙含量检测前处理工艺,采用高效液相色谱法测定人参总皂甙含量,并通过线性关系、精密度试验、重复性试验
2、、稳定性试验、加样回收试验考察此方法的科学性与可行性。结果:原料前处理的最佳工艺为氧化镁加入量 0.10 g,过 40 目筛,在 50 条件下超声提取 1.5 h;方法精密度、重复性、稳定性良好,平均加样回收率为99.4%。结论:本文确立了人参茎叶原料的最优前处理方法,为人参皂甙含量的检测提供参考。关键词:人参茎叶;人参皂甙;正交实验;方法学中图分类号:S567.5 文献标识码:AOptimizationofPretreatmentTechnologyandMethodologyforDetectionofGinsenosideinStemandLeavesofPanax ginsengYAN
3、G Jingxia,LIU Kaihua,MAO Hua,ZHANG Liangming*,YANG Yang(Xian Tianyi Biotechnology Co.,Ltd.,Xian 710000,China)Abstract:Objective:To optimize the pretreatment technology of ginsenoside in stem and leaf of Panax ginseng,determine the detection method for stem and leaves of Panax ginseng raw materials,a
4、nd conduct methodological studies.Methods:The optimal pre-treatment process for the detection of ginsenoside content in stem and leaves of Panax ginseng is optimized using orthogonal experiments.The total ginsenoside content is determined by high-performance liquid chromatography,and the scientific
5、and feasibility of this method is investigated through linear relationship,precision test,repeatability test,stability test,and sample recovery test.Results:The optimal pretreatment process of raw materials is to add 0.10 g of magnesium oxide,pass through a 40 mesh sieve,and extract it by ultrasound
6、 at 50 for 1.5 hours.The method has good precision,repeatability,and stability,with an average spiked recovery rate of 99.4%.Conclusion:The pretreatment method of stem and leaves of Panax ginseng raw materials is established to provide reference for the detection method of ginsenoside content.Keywor
7、ds:stem and leaves of Panax ginseng;ginsenoside;orthogonal experiment;methodology人参(Panax ginseng C.A.Mey.)为五加科植物的干燥根及根茎1。神农本草经 记述人参具有主补五脏、安精神、定魂魄、止惊悸、除邪气、明目益智,久服轻身延年的功效2。人参的主要活性成分为人参皂甙,广泛分布于人参各个部位3。迄今为止,人们已从人参中分离鉴定出 40 余种人参皂苷单体,人参皂苷属于三萜类皂苷4。人参茎叶为人参的地上部分,为了充分利用人参资源,人们对人参的研究已拓展到茎叶部分。研究表明,人参茎叶皂苷不仅具有抗肿
8、瘤、抗菌抗病毒、保肝护心、提高免疫、促进细胞增殖等功效,在缓解疲劳方面也起到一定的作用4-6。人参茎叶原料质量来源不一,对原料的验收标作者简介:杨景霞(1988),女,甘肃会宁人,本科,助理工程师,研究方向为天然产物分离纯化等。通信作者:张良明(1987),男,陕西汉中人,本科,助理工程师,研究方向为天然产物分离纯化等。E-mail:。第 4 期79杨景霞等:人参茎叶中人参皂甙含量检测前处理工艺优化及方法学考察准较为模糊。一方面药典中原料的检测方法主要针对人参叶中人参皂甙 Rg1 与人参皂甙 Re,原料的前处理比较复杂,用时较长;但人参茎中也含有人参皂甙,在大生产中,会对茎和叶整柱利用,而不会
9、仅利用叶子。另一方面由于采用药典中检测人参叶的方法对人参茎叶中皂甙含量进行检测的结果偏低,一般Rg1+Re 含量不超过 1.2%,与生产的最终产品转移率不对应。因此,认为采用药典中检测人参叶中皂甙含量的方法不适用于人参茎叶整柱的检测。结合药典中人参茎叶提取物及市场对人参茎叶提取物的活性成分要求(Rg1、Re、Rd 的总量应为30%45%),本研究以这 3 种活性成分总和为标准,采用正交实验进行原料前处理条件的优化,确定人参茎叶原料的检测方法并研究其方法的可靠性、准确性,为人参茎叶原料中人参皂苷的检测提供参考。1 材料与方法1.1 仪器与设备Agilent 1100高效液相色谱仪,美国Agile
10、nt公司;SQP 十万分之一分析天平,瑞士 Mettler Toledo 公司;KQ-600DV 台式数控超声波清洗器,昆山市禾创超声仪器有限公司。1.2 试剂与材料人参茎叶,采摘自吉林省白山市抚松县,经西安天一生物技术有限公司质量部显微鉴定为五加科植物人参的干燥叶。人参皂甙 Rg1 对照品(110703202034)、人参皂甙 Re 对照品(110754202129)、人参皂甙 Rd 对照品(111818202104),中国食品药品检定研究院;甲醇,色谱纯,德国MERCK公司;乙腈,色谱纯,德国 MERCK 公司;磷酸,分析纯,天津科市恒兴试剂制造有限公司;甲醇,分析纯,天津科密欧公司;氧化
11、镁,分析纯,福晨天津化学试剂有限公司。1.3 实验方法1.3.1 溶液制备(1)混合对照品溶液的制备:精密称定人参皂苷 Rg1(94%)对照品 16.02 mg、人参皂苷 Re(96%)对照品 24.37 mg 和人参皂苷 Rd(97.3%)对照品10.33 mg,加甲醇溶解后,定容于 50 mL 的容量瓶,制成混合对照品溶液。(2)供试品溶液制备:取 5 g 粉碎后过 40 目筛的人参茎叶原料置250 mL三角瓶中,加0.10 g氧化镁,再加入约 200 mL 自来水,60 超声提取 1.5 h,提取结束后放凉,提取液过滤至 250 mL 容量瓶中。提取渣用水洗,定容至 250 mL 容量瓶
12、,摇匀,即得。1.3.2 色谱条件与系统适用性条件色 谱 柱:Agilent Extend C18色 谱 柱(250 mm 4.6 mm,5 m);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B);梯度洗脱(0 30 min,流动相 A 19%,流动相B 81%;30 35 min,流动相 A 19%24%,流动相B 81%76%;35 60 min,流动相 A 24%40%,流动相 B 76%60%);柱温 30;流速 1.3 mL/min;检测波长 203 nm;理论塔板数按人参皂甙 Rg1 峰计算应不低于 6 0001。此条件下人参茎叶供试品中各组分峰形较好,共存成分不干扰人参皂甙的检测,所得
13、高效液相色谱图见图 1。1.3.3 人参总皂甙含量的测定在 1.3.2 色谱条件下,待仪器稳定基线平稳后,分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10 L,注入高效液相色谱仪测定。用外标法计算样品中人参总皂甙的含量。1.4 方法学考察1.4.1 人参茎叶原料前处理条件优化实验在前期单因素实验的基础上,以氧化镁加入量、原料粉碎粒度、提取温度、超声时间为考察因素,每个因素各取 3 个水平,以人参总皂甙为考察指标,设计正交实验因素水平表,见表 1。表 1 因素水平表水平因素A 加氧化镁的量/g B 粒度/目 C 提取温度/D 超声时间/h10.0525501.020.1040601.530.15607
14、02.01.4.2 人参茎叶原料中总皂甙最佳提取工艺验证实验根据正交实验确定的最佳提取工艺,进行三批次验证,通过 1.3.2 项下方法测定人参总皂甙含量,以确保该条件为最佳提取工艺。1.4.3 线性关系考察精密吸取 1.3.1 项下人参皂甙混合对照品溶液 80生物化工2023 年5 L、10 L、15 L、20 L、25 L 和 30 L,注入高效液相色谱仪,按 1.3.2 项下色谱条件测定,以进样量为横坐标,人参总皂甙含量为纵坐标,进行线性回归。1.4.4 精密度试验取 1.3.1 项下配制的供试品溶液 10 L,按 1.3.2项色谱条件连续进样 6 次,分别记录人参皂甙 Rg1、Re、Rd
15、 的峰面积,计算人参皂甙总含量。1.4.5 重复性实验取同产地同一批人参茎叶样品粉末约 5 g,按1.3.1 项方法制备 6 份供试品溶液,按 1.3.2 项色谱条件测定人参总皂甙的含量,记录数据。1.4.6 稳定性实验精密吸取 1.3.1 项配制的人参茎叶样品供试品溶液,按 1.3.2 项色谱条件测定人参总皂甙的含量,每间隔 2 h 进样一次,每次 10 L,重复 6 次,记录 12 h 内人参总皂甙的含量。1.4.7 加样回收实验取 9 份已知含量的人参茎叶粉末(批号 Y220101)约 5.0 g,精密称定后置于圆底烧瓶,分别加入 1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL 的对照品溶液,
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