氢氧化钙糊剂浸提液对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响.pdf
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1、文章编号()论 著氢氧化钙糊剂浸提液对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响马艳霞,李泽汉,曹灵,张筱岚,于金华(南京医科大学附属口腔医院牙体牙髓科,江苏省口腔疾病研究重点实验室,江苏省口腔转化医学工程研究中心,江苏 南京;南京医科大学附属口腔医院儿童口腔预防科,江苏 南京)摘要 目的:研究氢氧化钙糊剂浸提液对大鼠骨髓间充质干细胞()成骨向分化的影响,为其临床使用提供理论依据。方法:全骨髓贴壁法分离培养大鼠,流式细胞仪进行细胞鉴定,不同条件诱导细胞后进行茜素红染色、油红 染色及阿利新蓝染色,鉴定细胞成骨、成脂及成软骨分化能力。将氢氧化钙糊剂烘干、研磨成粉后,制作氢氧化钙糊剂浸提液及氢氧化钙糊剂条件
2、培养基(),使用不同浓度(、)培养大鼠,碱性磷酸酶()活性测定筛选最佳作用浓度用于后续实验。大鼠 经 诱导后,染色、活性测定、茜素红染色检测其 活性及矿化能力的变化,检测细胞成骨相关指标型胶原()、相关转录因子()、成骨细胞特异性转录因子()的表达水平变化。结果:成功分离培养了大鼠,具有成骨、成脂及成软骨分化等间充质干细胞特性;为 诱导大鼠 活性的最佳作用浓度(),使用该浓度 培养基处理大鼠 后,、表达上调()。结论:氢氧化钙糊剂浸提液可促进大鼠 成骨分化。关键词 氢氧化钙糊剂浸提液;骨髓间充质干细胞;成骨分化中图分类号 文献标识码 ,(,;,):,:,:,()(,),(),(),(),:,(
3、),():;基金项目:国家自然科学基金面上项目(,);江苏省科教能力提升工程 江苏省研究型医院(),江苏省医学创新中心()通信作者:于金华,:牙髓组织可受龋齿、外伤、解剖变异的影响,导致牙髓炎和根尖周炎的发生。根管治疗可有效去除感染的牙本质和牙髓组织,促进炎症恢复,防止牙根和牙冠再感染。其中,氢氧化钙糊剂作为主流根管消毒制剂,临床使用最为广泛,它由氢氧化钙()、碳酸铋()及水、甘油、聚乙烯乙二口腔生物医学 年 月(第 卷第 期),醇和其他辅助剂的混合物()组成,具有杀菌作用强、刺激性小、促进根尖骨质形成和根尖孔封闭等优点。有研究表明氢氧化钙可下调经典 信号通路的表达,促进干细胞的成骨向分化和矿
4、化以及成牙本质向分化。牙髓血运重建术中,根尖区刺激形成的血凝块含有大量干细胞,其中就有较丰富的骨髓间充质干细胞(,)。由于 优越的增殖和多向分化能力,多用于干细胞疗法。有研究证明,在牙齿软硬组织再生中起重要作用。本实验旨在研究氢氧化钙糊剂浸提液对大鼠 成骨分化的影响,为根管消毒过程中氢氧化钙糊剂的临床应用提供实验依据。材料与方法 实验动物和主要试剂 周龄 级 大鼠(由南京医科大学医药实验动物中心提供)共计 只。氢氧化钙糊剂(,瑞士),培养液、磷酸缓冲盐溶液(,)、胎牛血清(,)、胰蛋白酶、青链霉素抗生素(,美国),成脂分化培养基、成软骨分化培养基(,美国),溴氯吲哚磷酸盐 硝基四氮(,)、碱性
5、磷酸酶(,)显色试剂盒、蛋白裂解液、苯甲基磺酰氟(,)、一抗稀释液、蛋白测定试剂盒(上海碧云天),活性测定试剂盒(南京建成),抗甘油醛磷酸脱氢酶(,)抗体(,美国),相关转录因子(,)抗体(,美国),、成骨细胞特异性转录因子()、型胶原 (,)抗体(,美国),山羊抗兔 辣根酶标记(北京中杉金桥),凝胶快速制备试剂盒(上海雅酶),增强型化学发光试剂(,)、聚偏二氟乙烯膜(,)(,美国),(,美国)。本实验通过南京医科大学附属口腔医院伦理委员会审查批准()。方法 大鼠 原代培养采用全骨髓贴壁法提取大鼠。脱颈法处死 大鼠,于 乙醇内浸泡消毒 。无菌条件下分离 大鼠的双侧股骨和胫骨,注射器吸取,冲洗骨
6、髓腔内容物,离心,弃上清液,加入 完全培养基(含、双抗的 培养基),吹匀,接种到直径为 的培养皿中,置于 、湿度的细胞孵箱内培养。原代细胞培养 后换液,之后每 更换培养液,待细胞融合至时,用 胰酶消化传代,本实验使用生长状态良好的第 代大鼠。流式细胞鉴定大鼠 在完全培养基中培养,当细胞融合至 左右时消化收集细胞,重悬,加入荧光偶联抗体(、),对细胞进行洗涤和重悬,使用流式细胞仪检测染色细胞。成骨培养大鼠 在含 抗坏血酸、甘油磷酸钠和 地塞米松的矿化诱导培养液(,)中培养。后,乙醇固定 后,用 茜素红染色。使用倒置显微镜观察并拍摄染色样品。成脂培养将状态良好的大鼠 接种于 孔板上,用成脂培养基培
7、养 ,最后用油红 试剂染色脂滴。使用倒置显微镜观察并拍摄染色样品。成软骨培养大鼠 用成软骨培养基培养 后,用阿利新蓝染色检测软骨球。使用倒置显微镜观察并拍摄染色样品。氢氧化钙糊剂条件培养基(,)根据参考文献改良并制备氢氧化钙糊剂浸提液:取适量氢氧化钙糊剂于培养皿中,放置 烘箱内干燥,待其完全固化后研磨成粉,用 筛子过滤后与 培养液以 的质量 体积比充分混合,置于 孵箱内,每 震荡;后 离心 ,收集上清液,滤菌器过滤后与完全培养基混合,制备不同浓度(、)。筛选 的最佳诱导浓度将状态良好的大鼠 接入 孔板,分别用不同浓度(、)培养 。洗 次,吸干后加入含 的 裂解马艳霞,等氢氧化钙糊剂浸提液对大鼠
8、骨髓间充质干细胞成骨分化的影响液,冰上慢摇 ;用细胞刮子刮下细胞并移液至 管中,冰上进行超声裂解;、离心 ,收集上清液,按 活性测定试剂盒使用说明检测各组 活性,实验重复 次。不同培养基对大鼠 活性及矿化能力的影响将状态良好的大鼠 接种于 孔板上,分为 组,以完全培养基培养为对照组,以 培养记为 培养组,培养记为 培养组,和 培养记为 培养组,孵育;根据使用说明,采用 染色试剂盒进行 染色;使用倒置显微镜观察并拍摄染色样品;实验重复 次。将状态良好的大鼠 接入 孔板上,分组同上,孵育 后检测各组 活性,具体实验方法同。将状态良好的大鼠 接种于 孔板上,分组同上,孵育 ;乙醇固定 后,用茜素红染
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