人表皮生长因子原核表达及活性鉴定.pdf
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1、第 卷 第 期 年 月山 东 理 工 大 学 学 报(自 然 科 学 版)().收稿日期:第一作者:黑丽莎女.通信作者:刘文女.文章编号:()人表皮生长因子原核表达及活性鉴定黑丽莎 王俊飞 李彦婷 陈远哲 高佳佳 刘文(山东理工大学 生命与医药学院 山东 淄博)摘要:人表皮生长因子()是由 氨基酸组成的小分子多肽它通过与膜受体的相互作用调节多种类型的细胞增殖 为获得具有生物活性的基因工程产品 设计在 基因 端插入功能序列与基因融合经合成基因、双酶切连接构建了重组原核表达载体 并导入大肠杆菌 菌株 工程菌在 培养基中培养至对数生长期并在 温度条件下诱导表达蛋白 以 /离心收集细胞利用超声波破碎细
2、胞以 /离心 收集包涵体沉淀 含有 的包涵体溶解后采用 柱纯化目的蛋白并用 鉴定目的蛋白 利用免疫组化反应和 方法分析 与其膜受体 的特异性结合活性和细胞增殖活性 结果显示融合蛋白 得到高效表达表达量在 左右纯化的蛋白浓度为./与膜受体能发生特异性结合具有明显的促细胞增殖活性本研究构建了表达生物活性 的工程菌为 进一步的临床和开发应用提供依据关键词:重组人表皮生长因子原核表达分离纯化活性鉴定中图分类号:文献标志码:():().()././.()./.:表皮生长因子()是一种多肽类生长因子广泛存在于哺乳动物体内通过膜受体(即)酪氨酸蛋白激酶()信号途径使 自身磷酸化作用在细胞内激活蛋白酶和磷酸酯
3、酶等的一系列生化反应 促进体内、和糖等低分子物大量进入细胞糖酵解量增大 促进 与蛋白质合成增 多 促 进 合 成 等 发 挥 多 种 生 物 学 活性 另有研究表明 内、中、外 个胚层的细胞均有 存在 具有抑制胃酸分泌、促进细胞增殖、改善毛细血管形成、调控并阻止细胞凋亡、与肿瘤发生相关等生物活性 在临床上可用于皮肤角膜修复、烧伤治疗、促伤口愈合、胃溃疡治疗、抗衰老等方面 由于其独特的上皮细胞修复和抗衰老功能在医美领域也得到高度关注和应用人()是由 氨基酸组成的单链多肽分子量较小只有约.由于氨基酸组成上有 个 形成了 个链内二硫键所以结构相对稳定对酸热环境有一定抗性适合进行基因工程表达制备 由于
4、该多肽没有糖基化位点现有的基因工程表达系统都可以使用但从成本控制和产业化工艺上使用原核表达系统进行基因工程表达制备 是比较理想的选择 本文利用人源 编码基因并在基因上游插入编码活性肽信号的碱基序列构建原核表达载体导入宿主菌诱导表达出目的蛋白经纯化和功能鉴定证实原核表达的融合人 具有良好的生物活性 材料与方法.材料与试剂表达受体菌为大肠杆菌()菌株原核表达载体使用 二者均为本实验室保存 和 内切酶、连接酶是 公司产品 细胞株为/()为小鼠胚胎成纤维细胞购自中国科学院细胞中心 标准品、一抗()和荧光标记抗鼠抗体二抗(/)均购买自生工生物工程(上海)股份有限公司 培养基所用酵母抽提物和蛋白胨为 公司
5、产品 细胞培养基、胎牛血清、胰蛋白酶等都为国产制剂 实验中使用的其他试剂为国产分析纯产品 蛋白纯化用 柱()购自 公司.方法.基因设计与表达载体构建参照 公布的 基因序列并进行大肠杆菌偏好密码子的修饰确定基因序列 将一段 的功能序列插入 基因 端而 端插入 标签编码序列 通过这一设计不仅适当放大了 的分子量便于基因表达同时具有黏附和跨皮肤活性的功能序列会促进 更好地发挥功能 标签的加入可方便后续目的蛋白的高纯度工程化制备 设计的融合()基因上下游分别引入限制核酸内切酶 和 位点序列以便与原核表达载体 进行重组结合 构建的 基因序列提交上海生物工程公司合成基因 将含有目的基因的克隆载体和表达载体
6、 同时进行 和 双酶切连接酶链接构建重组表达载体经转化 菌株涂布在含氨苄青霉素(/)的 平板挑选出阳性单克隆具体操作参考文献的相关章节 阳性克隆的表达载体基因测序由生工(上海)生物工程公司完成.融合蛋白 诱导表达将测序正确的重组表达载体工程菌克隆用 培养基 培养过夜按照 比例转接到 培养基中 振荡培养至对数期 水浴摇床诱导表达 /离心 收集菌体并用磷酸盐缓冲液()重悬菌体冰浴中超声破碎(超声 间隔 共 个循环输出功率)/分别取上清和沉淀组分进行 电泳鉴定 具体操作过程见参考文献的相关描述.融合蛋白 的纯化目的蛋白在沉淀组分中说明是以包涵体形式表达 包涵体预先用 /溶液洗涤 /离心 去掉其中的部
7、分杂蛋白然后包涵体沉淀用 缓冲液重悬添加 /脲第 期 黑丽莎等:人表皮生长因子原核表达及活性鉴定将包涵体溶解 样品溶液加到预处理好的 柱上并用含 /脲的 缓冲液冲洗 个柱体积并收集洗脱液此为非特异洗脱之后用含有不同浓度咪唑洗脱液进行特异性洗脱分别收集每个浓度的特异洗脱组分并进行 电泳鉴定最后要用含一定浓度脲的 缓冲液对含目的蛋白的组分进行透析透析液中脲的浓度要逐渐降低至蛋白不聚集为准 换一次透析液透析约 具体操作见参考文献 蛋白浓度采用紫外分光光度法测定.免疫组化实验免疫组化可以检测 与膜受体特异性结合活性情况 具体方法参照文献进行 取 培养 的/()细胞用胰蛋白酶消化后加入 完全培养基重悬细
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