肉桂精油脂质体的制备及理化性质研究.pdf
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1、肉桂精油脂质体的制备及理化性质研究涂倩,简玉英,谢大明,曾珍,刘韫滔,王彩霞,胡滨,李诚(四川农业大学食品学院,四川雅安,6 2 50 0 0)食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIESD0I:10.13995/ki.11-1802/ts.033099引用格式:涂倩,简玉英,谢大明,等.肉桂精油脂质体的制备及理化性质研究J.食品与发酵工业,2 0 2 3,49(17):19 4-2 0 1.TUQian,JIAN Yuying,XIE Daming,et al.Preparation and physicochemical properties of cinnam
2、on essential oil liposomes J.Food and Fermentation Industries,2023,49(17):194-201.摘要设置单因素试验和响应面法优化肉桂精油脂质体的制备工艺参数,并对其粒径、电位、微观形态、热稳定性、红外光谱、体外释放、抑菌性能进行研究。结果表明,制备的最佳工艺为:磷脂与胆固醇质量比4.0 9:1(磷脂质量浓度为10.2 3mg/mL,胆固醇质量浓度为2.5mg/mL)、肉桂精油质量浓度2.46 mg/mL、吐温-8 0 质量浓度2.99mg/mL,磷酸盐缓冲液用量40 mL(0.0 1m o l/L,p H 7.2),此条件下得
3、到包埋率为8 1.95%。微观结构分析得出,肉桂精油脂质体呈单层囊泡状。其粒径为94.2 1nm,多分散系数为0.133,Zeta电位为-40.4mV,具有纳米尺寸,且乳液具有良好的稳定性。热稳定性分析显示,肉桂精油脂质体的热稳定性相较于空白脂质体略有下降。红外光谱结果表明,肉桂精油与脂质体中的非极性头部之间形成氢键。此外,体外释放试验中,2 4h累计释放率为7 9.2 3%,证实脂质体的包埋对肉桂精油具有缓释效果。抑菌性能试验表明,肉桂精油脂质体对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有长效抑菌作用。该研究获得了一种稳定性较好、包埋率较高、缓释效果较好的肉桂精油脂质体,为肉桂精油在功能性食品领域中的开发
4、应用提供技术支持。关键词肉桂精油;脂质体;工艺优化;释放;抑菌活性肉桂精油是从肉桂叶和树皮中提取的次级代谢产物,呈黄色黏性状,含有肉桂醛、香芹酚、香叶醇、芳樟醇及-水芹烯等一系列活性物质,具有抑菌、抗氧化、消炎镇痛、抑制癌细胞生长繁殖等多种生理功能 。肉桂精油作为一种天然防腐剂,对食源性致病菌和腐败菌(大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌等)的生长表现出良好的抑制作用,此外,精油中的烯枯类、醛类等活性成分亦赋予其较强的抗氧化活性2 。然而,肉桂精油稳定性和水溶性差、对环境敏感以及伴有强烈的气味,限制了其应用范围3。脂质体是由磷脂分子在水溶性中形成具有双分子层结构的闭合囊泡,可同时包裹疏水性和亲水性物
5、质,具有生物相容性、两亲性、缓释等优点,在食品、医药、化妆品等领域有重要应用前景4。作为一种运载体系,脂质体不仅可增强被包封物质的稳定性,还可延长活性物质在体内的保留时间,达到缓释作用。将精油制备成脂质体这一载体形式,不仅可有效降低环境因素(如氧气、光、温度等)对肉桂精油的不利影响,还可掩盖精油的刺激性气味,提高感官属性和精油的生物利用度。近年来,随着研究的不断深入,学者们对精油脂第一作者:硕士研究生(李诚教授为通信作者,E-mail:l i c h e n g t e a m 16 3.c o m)基金项目:四川省科技计划项目(2 0 2 0 YFN0147)收稿日期:2 0 2 2-0 7
6、-2 7,改回日期:2 0 2 2-0 8-121942023 Vol.49 No.17(Total 485)质体的研究逐步展开。例如,刘玉兰5 采用乙醇注人法制备了肉桂醛脂质体,通过考察保留率、粒径等理化指标,证明了脂质体的稳定性。李伟6 通过薄膜超声分散法将肉桂精油/-环糊精包合物包封于脂质体内,再通过冻融方法制得包埋肉桂精油/-环糊精的蛋白脂质体,通过体外释放证实了蛋白脂质体运载体系具有控释抗菌作用。高压微射流均质技术制备的脂质体具有粒径小、分散均匀且避免使用有毒试剂的特点,但目前关于采用该技术优化制备肉桂精油脂质体的报道尚未出现。鉴于此,本研究采用薄膜分散-高压均质法制备肉桂精油脂质体
7、,以包埋率和平均粒径为指标对制备工艺进行优化,并对其zeta电位、形貌、热稳定性、红外光谱、体外释放及抑菌性能等理化性质进行考察。研究旨在开发一种包埋率较高、稳定性好、缓释效果好的脂质体运载体系,以扩大肉桂精油的应用范围。1材料与方法1.1 材料与试剂肉桂精油(纯度8 5%),上海源叶有限公司;蛋黄卵磷脂(纯度90%)、胆固醇(纯度95%)、吐温-8 0,研究报告上海生工生物工程股份有限公司;磷酸盐缓冲液表1试验因素水平表(PBS,0.0 1m o l/L,p H 7.2),北京索莱宝科技有限公Table 1Table of test factor levels司;大肠杆菌(ATCC25922
8、)、金黄色葡萄球菌(ATCC因素6538),嘉楚生物工程有限公司。A磷脂与胆固醇质量比1.2主要仪器设备B肉桂精油质量浓度/(mg/mL)C吐温-8 0 质量浓度/(mg/mL)Nano-ZS马尔文分析仪,英国马尔文仪器有限公司30 0 1-2 2 0 7 酶标仪,美国赛默飞有限公司;AH-BASIC高压均质机,安拓思纳米技术有限公司;RCD-1A高速均质机,常州越新仪器制造有限公司;NicoletIS10傅里叶红外色谱仪,赛默飞世尔科技有限公司;Q200MDSC差示扫描量热仪,美国TA公司;597 50 气相质谱联用仪,美国Agilent公司。1.3实验方法1.3.1肉桂精油脂质体的制备将一
9、定比例的蛋黄卵磷脂、胆固醇、吐温-8 0、肉桂精油溶于2 5mL无水乙醇中溶解混匀后转移至圆底烧瓶中,置旋转蒸发仪上减压蒸发(45,40r/min),除去有机溶剂,形成脂质薄膜,再加人PBS超声水化得到悬浊液,然后利用高速分散机在10000r/min下剪切2 min,最后在6 0 MPa高压均质下循环3 4次得到肉桂精油脂质体。1.3.2单因素试验设计分别探究:(1)在胆固醇与肉桂精油、吐温-8 0 质量比为1:1:1的条件下,磷脂与胆固醇质量比(1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1);(2)在磷脂与胆固醇、吐温-80质量比为4:1:1的条件下,肉桂精油质量浓度(1、1.5、2、2.
10、5、3、3.5m g/m L);(3)在磷脂与胆固醇、精油质量比为4:1:1条件下,吐温-8 0 质量浓度(1、1.5、2、2.5、3、3.5m g/m L);(4)在磷脂与胆固醇、精油、吐温-8 0 质量比为4:1:1:1的条件下,PBS用量(2 0、30、40、50、6 0、7 0 m L)对肉桂精油脂质体平均粒径和包埋率的影响。单因素试验优化某一参数时,分别固定磷脂与胆固醇质量比4:1(磷脂质量浓度为10mg/mL,胆固醇质量浓度为2.5mg/mL),肉桂精油质量浓度2.5mg/mL,吐温-8 0 质量浓度2.5 mg/mL,PBS用量40 mL。1.3.3响应面优化试验设计根据单因素试
11、验结果,筛选出磷脂与胆固醇质量比(A)、肉桂精油质量浓度(B)、吐温-8 0 质量浓度(C)作为考察对象,包埋率(Y)为因变量,利用Box-Behnken设计对肉桂精油脂质体的制备工艺参数进行优化,试验因素及编号见表1。水平-103:14:122.522.51.3.4肉桂精油脂质体理化性质的表征1.3.4.1肉桂精油包埋率的测定肉桂精油标准曲线的制备:精密称取肉桂精油100mg置10 0 mL容量瓶中,无水乙醇稀释定容制得1mg/mL母液。取母液分别配制10 0、8 0、6 0、40、2 0、10g/mL系列溶液,以无水乙醇为空白参比,在2 90 nm波长下测吸光度,计算得到标准曲线为:y=0
12、.0084x+0.0667,R=0.9984,该范围内线性较好。参考李畅等7 的方法稍作修改,取1mL脂质体于10 mL的离心管中,加4mL石油醚,涡旋混匀后离心(6 0 0 0 r/min,10 m in),收集上清液,重复操作2 次后合并有机相,无水乙醇定容至2 5mL,在2 9 0 nm处测定吸光度,按上述标准曲线计算游离精油含量A1。另取1mL脂质体,用无水乙醇稀释定容至2 5mL,水浴超声1h,测定吸光度值并计算肉桂精油总含量A2,按公式1)得出包封率:A,-A1EE/%=100A2式中:EE,肉桂精油包埋率,%;Ai,游离肉桂精油含量,mg;A2,肉桂精油总含量,mg。1.3.4.
13、2透射电镜(transmission electronmicroscope,TEM)参考CHAVES等8 的方法,将少量肉桂精油脂质体滴加于10 0 目铜网上,自然风干后用10 g/L磷钨酸进行负染,晾干后进行TEM分析。1.3.4.3粒径、聚合物分散性指数(polymerdispersi-ty index,PDI)及zeta电位的测定参考郝静梅等9 的方法,样品用超纯水稀释10 0倍后,采用马尔文分析仪测定其平均粒径、PDI及zeta电位。1.3.4.4美差示扫描量热分析(differential scanningcalorimetry,DSC)参考顾家毓等【10 的方法,取5mg经干燥的样
14、品置于中,以空白埚为对照,N为载气,10/m in 速度从2 5加热至10 0,研究分析脂质体的热至相变情况。1.3.4.5傅里叶红外光谱分析(Fouriertransformin-2023 年第 49 卷第17 期(总第 48 5 期)19515:133(1)食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIESfrared spectrometer,FTIR)参考ZHANG等I的方法,将样品与KBr混匀压片后,在40 0 0 50 0 cm=红外波段内对肉桂精油、肉桂精油脂质体进行光谱分析。1.3.4.6体外释放分析采用透析法12 1进行,取2 mL脂质体于透析袋(14k
15、 u)中,置于10 0 mLPBS中并在2 5下连续振荡(2 0 0 r/min),分别在0.5、2、4、6、8、12、2 4、3 6、48、60、7 2 h 定时取样,同时补充等量缓冲液,在2 9 0 nm处测定吸光度,计算肉桂精油累计释放量,并对体外释放结果进行动力学拟合分析。1.3.4.7肉桂精油脂质体抑菌性能分析将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌活化后,加7.5g/L生理盐水稀释菌悬液,分别取4mL肉桂精油脂质体和10 g/L吐温-8 0 稀释的肉桂精油溶液于不同菌悬液中,体积分数为40%,3 7 振荡培养,每隔1d取样进行菌落计数。1.3.5数据处理与分析采用Design-Expert8.0
16、.6.1进行响应面设计与分析,Origin2018进行数据处理。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1蛋黄卵磷脂与胆固醇质量比胆固醇是类脂质的主要成分,常作为脂质体的稳定剂13 1,在适宜的浓度下,亲水性羟基基团与磷脂分子极性基团形成氢键,利用氢键间相互作用来调解脂膜的刚性和致密性,能极大地稳定脂质体结构,进而稳定脂质体的负载能力。图1-a结果显示,随着磷脂与胆固醇质量比的增大,包埋率显著增加后降低,平均粒径先减小后增加,当质量比为4:1时,包埋率达最大(7 6.2 3%),平均粒径最小(9 1.18 nm)。脂质体的浓度与其负载能力均会影响精油的包埋率,当磷脂与胆固醇质量比增加时,形成的
17、脂质体分子增多且平均粒径逐渐减小,结构逐渐趋于稳定,导致包埋率显著增大。当质量比大于4:1后,包埋率反而呈下降趋势,且平均粒径逐渐增大,这是由于磷脂浓度过高影响了脂质体膜的形成,降低了脂质体电荷之间的静电排斥作用,聚集现象出现导致粒径增大14,此时的脂质体浓度高但体系不稳定,精油泄露,负载能力显著减弱,致使包埋率降低。本试验研究结果与前人研究结果相似15。综合考虑确定磷脂与胆固醇的最佳质量比为4:1,此时包埋率最大、粒径最1962023 Vol.49 No.17(Total 485)小、负载能力较好。2.1.2肉桂精油质量浓度图1-b结果表明,肉桂精油质量浓度从1mg/mL增加到2.5mg/m
18、L,包埋率从6 2.48%增加到最大(8 1.2 6%),当精油质量浓度超过2.5mg/mL时,包埋率逐渐降低,证明肉桂精油浓度过低或过高均不利于精油脂质体的形成,同时磷脂形成的脂质体具有一定的空间承载能力16 。当肉桂精油浓度较低时,包埋率偏低,这可能是精油在低浓度下与脂质体体系接触机率较少所致;随着肉桂精油添加量增多,接触机率增加,包埋率随之增加;当添加量超过脂质体的负载能力时,再添加更多肉桂精油,亦不能被包埋于脂质体,最终导致包埋率降低。而平均粒径随肉桂精油浓度的增加先降低后逐渐增大,当肉桂精油为2mg/mL时,粒径最小为8 7.17 nm,出现此现象的原因是精油添加量超出了脂质体空间负
19、荷,干扰磷脂间相互作用力,导致磷脂双分子层结构的柔韧性和致密性减弱,致使双分子层膨胀,粒径增大17 。综合分析,选择肉桂精油质量浓度为2.5mg/mL较为理想,此时包埋率最大,粒径相对较小。2.1.3吐温-8 0 质量浓度由图1-c可知,随着吐温-8 0 质量浓度增加平均粒径呈持续下降趋势,包埋率先增大后减小,当吐温-80质量浓度为2.5mg/mL时,包埋率达最大(7 9.7 4%),而当浓度继续增加,包埋率减小。吐温-80是一种呈亲水性长链结构的化合物,通过物理吸附在脂质体膜表面形成一定厚度亲水层,具有空间位阻效应,使得脂质体系统牢固18 ;然而过量的吐温-80的加入导致乳化过度,脂质体囊泡
20、被溶解,平均粒径降低,同时造成脂质体内空间受限,不能对肉桂精油进行有效包埋19 。综合考虑,选择吐温-8 0 质量浓度为2.5mg/mL进行后续试验。2.1.4PBS 缓冲液用量由图1-d可知,平均粒径先降低随后趋于平稳且变化幅度较小,随着缓冲液用量的增加,脂质体体系浓度下降,粒子间更加均匀分布,使得平均粒径减少直到趋于平稳2 0 。肉桂精油脂质体包埋率随缓冲液用量增加逐渐升高,但缓冲液用量超过40 mL,包埋率略有下降。但过少的PBS,不利于脂质的水化过程,易产生聚集絮凝,从而导致包埋率较低。同时调查发现,本试验研究契合宋恭帅等2 1 的研究结果。综上,PBS的增加引起包埋率和平均粒径的变化
21、并不明显,确定PBS最佳用量为40 mL。研究报告a140r80四平均粒径+包理率130F120110100901:1200四平均粒径包理率180160140120F100E1.0图1磷脂与胆固醇质量比、肉桂精油质量浓度、吐温-8 0 质量浓度和PBS用量对肉桂精油脂质体包埋率、平均粒径的影响Fig.1Effects of mass ratio of phospholipid to cholesterol,mass concentration of cinnamon essential oil,mass concentration oftween 80 and PBS dosage on th
22、e embedding efficiency and average particle size of cinnamon essential oil liposomes2.2响应面优化分析利用Design-Expert软件对包埋率与各因素间的关系进行回归分析,响应面优化试验结果见表2。通过回归拟合得到多元回归方程为:Y=81.68+1.08A+3.53B+5.80C-2.57AB+0.55AC-4.58BC-9.82A-8.24B-6.21C2Table 2Response surface optimization test resultsB肉桂精油A磷脂与胆序号固醇质量比1021304050
23、6071809010-111012113114-115016-117-1b120四平均粒径115F包理率751101056510095609055852:13:1磷脂与胆固醇质量比1.52.0吐温-8 0 质量浓度/mg/mL)a-磷脂与胆固醇质量比;b-肉桂精油质量浓度;c-吐温-8 0 质量浓度;d-PBS用量表2 响应面优化试验结果均方模型1 440.01A9.33C吐温-8 0BY包埋率/质量浓度/质量浓度/(mg/mL)(mg/mL)0001-1-1-111100-100000011-10-1100-10010-1085807065604:15:12.53.06:1858075%/率
24、7065603.5%82.1474.0754.3373.0770.9782.3863.7780.7281.7870.8770.5659.3365.6958.3281.3768.6156.421.0d 110四平均粒径一包理率100u/2908070F6020根据表3 的方程分析,模型具有极显著性(P0.05);R=0.9932,可以解释9 9.3 2%的总变化,说明该模型拟合情况好,具有统计学意义。表3 响应面方差分析Table 3Response surface analysis of variance来源平方和自由度9160.00111.80 0.000 119.3399.691C269.
25、58AB26.37AC1.20BC84.00A24.406.05B2285.56C?162.39残差10.02失拟项8.29纯误差1.73总和1 450.03注:*表示P0.05,*表示P0.01。此外,线性系数A及相互作用系数AB对Y有显著影响(P0.05),线性(B、C)、相互作用系数(BC)和二次项系数(A、B、C)对结果达到极显著水平(P 0.0 1)。根据分析结果,影响包埋率的因素主次2023 年第 49 卷第 17 期(总第 48 5 期)19 71.5肉桂精油质量浓度/(mg/mL)3040PBS用量/mL99.691269.58188.370.000 1126.3711.201
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